劉文剛，張光遠，黎明，程祎，吳志榮，孔廣發(fā)，莫永軒

(1.東莞市濱海灣中心醫(yī)院 泌尿外科，廣東 東莞 523000; 2.東南大學附屬中大醫(yī)院 泌尿外科，江蘇 南京 210009)

近年來，隨著結(jié)石研究的不斷深入，免疫炎癥在草酸鈣結(jié)石形成過程中的作用機制被揭示。研究表明，在草酸鈣結(jié)石形成過程中，尤其是蘭德爾斑塊(Randall plaques,RPs)的形成過程中往往伴隨著免疫細胞的浸潤，不同免疫細胞比例的分布直接影響患者斑塊的形成與結(jié)石的發(fā)生[1]。Taguchi等[2]通過分析23例草酸鈣結(jié)石形成者(年齡和性別匹配)的腎乳頭和非乳頭旁邊組織及7例正常腎乳頭組織之間的基因表達發(fā)現(xiàn)，草酸鈣結(jié)石患者腎乳頭的骨橋蛋白、巨噬細胞(尤其是M1型巨噬細胞)及炎癥因子明顯升高或增多進而導(dǎo)致腎損傷和氧化應(yīng)激加重，另外，組織炎癥細胞因子的表達會導(dǎo)致免疫細胞的數(shù)量和細胞凋亡水平均增加。這一研究結(jié)果表明炎癥細胞因子在草酸鈣結(jié)石形成過程中發(fā)揮了重要作用。本研究則基于GEO數(shù)據(jù)庫進行差異表達基因(DEGs)篩選，獲取草酸鈣結(jié)石危險因素之一，即特發(fā)性高鈣尿(idiopathic hypercalciuria，IH)SD大鼠mRNA數(shù)據(jù)，進行生物信息學分析，從中篩選關(guān)鍵分子并構(gòu)建草酸鈣結(jié)石大鼠模型，并在大鼠腎組織中驗證關(guān)鍵基因的表達，為研究和干預(yù)草酸鈣結(jié)石形成提供新的分子靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.2 生物信息學分析

1.2.1 數(shù)據(jù)下載與預(yù)處理 從NCBI基因數(shù)據(jù)庫中篩選出IH大鼠數(shù)據(jù)集(GES75542)進行后續(xù)分析。首先對GEO數(shù)據(jù)集進行預(yù)處理和歸一化，然后用Limma R軟件包進行DEGs分析。倍數(shù)變化(FC)>2和校正P值(Padj.)<0.05作為DEGs篩查的臨界值。

1.2.2 GO與KEGG功能富集分析 GO分析對基因進行簡單的注釋，具體分為3個方面，即細胞生物進程(biological process，BP)、細胞組成(cellular component，CC)及分子功能(molecular function，MF)。KEGG則可進一步獲得基因參與的主要功能和代謝通路。本研究利用Metascape(http:∥metascape.org/)數(shù)據(jù)庫[3]進行GO與KEGG功能富集分析，并對富集最顯著的前20位通路進行可視化分析。

1.3 構(gòu)建草酸鈣結(jié)石大鼠模型

將20只SD雄性大鼠隨機分為兩組，即造模組(10只)和空白對照組(10只)。建模方法：第1周和第3周的前3天，灌胃1%氯化銨2 ml,且給予1%乙二醇飲用水飼喂?？瞻讓φ战M：第1周和第3周的前3天，灌胃鹽水2 ml,并給予正常飲用水飼喂。4周后處死大鼠，并收集腎臟組織，進行切片染色等。

1.4 免疫組化實驗

按照免疫組化試劑盒說明書進行實驗，孵育不同抗體進行檢測，顯微鏡下觀察組織存在棕黃色或棕褐色則為表達陽性，顏色深淺程度反映蛋白表達水平的強弱。以 PBS 取代一抗為陰性對照，實驗結(jié)果評價由2名研究者單獨評分完成。

1.5 統(tǒng)計學處理

所有實驗均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以平均值±標準差來表示。采用 SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，兩組間差異采用t檢驗進行比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 GSE75542數(shù)據(jù)集篩選出195差異表達基因

首先將GSE75542測序數(shù)據(jù)以熱圖的形式進行展示(圖1A)，接著對數(shù)據(jù)進行預(yù)處理與歸一化，減少測序誤差(圖1B)；利用Limma R軟件包進行DEGs分析，共篩選出146個上調(diào)的基因，49個下調(diào)的基因(P<0.05, log2FC<-1或log2FC>1)(圖1C)。

A.GSE75542數(shù)據(jù)熱圖;B.數(shù)據(jù)集的預(yù)處理；C.DEGs的火山圖(P<0.05, log2FC<-1 或 log2FC>1)圖1 GSE75542數(shù)據(jù)集中篩選DEGs

2.2 功能富集分析及PPI蛋白互作篩選關(guān)鍵蛋白

在Metascapes數(shù)據(jù)庫中對195個DEGs進行GO與KEGG的功能富集分析，并將富集在前20位的通路進行可視化(圖2A)。結(jié)果顯示，基因富集在GO:0032496:對脂多糖的反應(yīng)、GO:0010942：細胞死亡的正調(diào)控、GO:0002544:慢性炎癥反應(yīng)、GO:0006954：炎癥反應(yīng)、GO:0072593：活性氧代謝過程等代謝通路中；進一步分析各基因分布在具體通路中(圖2B)。對195個基因進行PPI蛋白互作分析結(jié)果(圖3A)顯示，score>20的基因共有10個，結(jié)合其基因功能，選定CXCL1、CXCL2、CXCL10、IL6、IL1B作為關(guān)鍵基因進行后續(xù)的實驗驗證(圖3B)。

圖2 DEGs的功能富集分析前20位(GO+KEGG)

圖3 DEGs的PPI分析圖(綠點：普通基因；紅點：score>20的 基因)

2.3 成功構(gòu)建草酸鈣結(jié)石大鼠模型

HE染色結(jié)果顯示，造模組大鼠腎組織切片在顯微鏡下可以看到腎小管中存在大量的草酸鈣晶體沉積，且腎小管管腔變大，周邊腎組織結(jié)構(gòu)紊亂(圖4A)；空白對照組大鼠腎組織無晶體沉積，且組織結(jié)構(gòu)無變化(圖4B)。

圖4 大鼠腎組織HE染色圖

2.4 草酸鈣結(jié)石大鼠模型炎癥蛋白表達

與空白對照組比較，造膜組CXCL1/2/10明顯表達增高(P<0.001)，IL6與IL1B表達增高(P<0.05)。見圖5。

圖5 兩組大鼠腎組織免疫組化結(jié)果

3 討 論

綜上所述，本研究基于GEO數(shù)據(jù)庫篩選和生物信息學分析，并結(jié)合實驗驗證，最終篩選出CXCL1/2/10 3個在草酸鈣結(jié)石大鼠腎組織中明顯升高的免疫炎癥蛋白，為草酸鈣結(jié)石的后續(xù)機制研究與免疫干預(yù)提供了新的分子靶點，也為治療泌尿系結(jié)石提供一種新方向。