王躍華，吳佳琪，王習(xí)著，胡 域,劉真珍,魏博坤,閻婷婷

(1.成都大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 610106; 2.湖北省浠水縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，湖北 黃岡 438200)

0 引 言

金線蓮(Anoectochilusroxburghii(Wall.) Lindl.)又名金線蘭、金絲草，為蘭科開唇蘭屬多年生草本植物，具有鎮(zhèn)咳、清熱與止痛等功效[1-2].在自然環(huán)境中，金線蓮種子的萌發(fā)需要相關(guān)真菌伴生，自然萌發(fā)率較低[3]，而且金線蓮的適應(yīng)性較差，對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求十分苛刻.近年來，人為過量采挖，造成金線蓮植物賴以生存的環(huán)境條件被破壞，野生金線蓮資源銳減[4].本研究采用生物工程的組織培育技術(shù)，篩選出金線蓮愈傷誘導(dǎo)組織、不定芽誘導(dǎo)分化和無根苗壯苗生根的最佳培養(yǎng)基配方，最終建立金線蓮再生植株的快速繁育體系，為金線蓮植物的快速繁殖及大規(guī)模栽種提供理論依據(jù)及技術(shù)支持.

1 材料與方法

1.1 材 料

實(shí)驗(yàn)所用金線蓮采自四川省都江堰市，經(jīng)鑒定為蘭科(Orchidaceae)開唇蘭屬的金線蓮(Anoectochilusroxburghii(Wall.) Lindl.).

1.2 方 法

1.2.1 不同外植體誘導(dǎo)愈傷組織

選取生長(zhǎng)健壯的金線蓮植物，放在超凈工作臺(tái)上用75%乙醇消毒10 s后，用無菌水沖洗3次，再放入0.1%的氯化汞中消毒8 min后，用無菌水沖洗3次，吸干水分后，切取葉柄、葉片、根、莖和芽各器官作為外植體，接入1/2 MS +NAA 0.6 mg/L+6-BA 1 mg/L的培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo).

1.2.2 不同激素配比對(duì)葉柄誘導(dǎo)愈傷組織的影響

以金線蓮葉柄為外植體，采用L9(33)正交試驗(yàn)進(jìn)一步篩選出不同激素配比對(duì)葉柄誘導(dǎo)愈傷組織的影響，具體因素水平見表1.

表1 誘導(dǎo)愈傷組織因素水平表

1.2.3 不同激素對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)分化不定芽的影響

選取由“1.2.2”項(xiàng)下葉柄誘導(dǎo)獲得的質(zhì)地較緊致愈傷組織，將其切成0.5 cm3大小接種到表2誘導(dǎo)不定芽的培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng).

表2 誘導(dǎo)不定芽因素水平表

1.2.4 不同激素對(duì)無根苗壯苗生根的影響

選取由“1.2.3”項(xiàng)下培養(yǎng)的生長(zhǎng)1.5～2 cm的不定芽為無根苗，接入以1/2 MS+活性炭1 g/L為基本培養(yǎng)基，并分別添加了不同濃度的6-BA和NAA，在溫度為(23±2)℃，光照強(qiáng)度為1 500～2 000 lx和光照時(shí)間為12 h/d的條件下誘導(dǎo)生根培養(yǎng).

1.2.5 煉苗與移栽

在培養(yǎng)室中，將組培瓶蓋打開放置12 h后，選取生長(zhǎng)有3～5片葉，苗高在4 cm以上的組培苗，用水沖洗掉根部的培養(yǎng)基后，移栽到育苗盆中，在溫度(20±2)℃，相對(duì)濕度在90%左右和光照強(qiáng)度為400 lx的條件下培養(yǎng).

1.3 計(jì)算方法

愈傷組織誘導(dǎo)率=(誘導(dǎo)愈傷組織數(shù)/接種外植體數(shù))×100%

不定芽誘導(dǎo)率=(產(chǎn)生不定芽數(shù)/接種外植體數(shù))×100%

生根率=(生根數(shù)/接種數(shù))×100%

存活率=(存活的外植體數(shù)/移栽組培苗數(shù))×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 不同外植體誘導(dǎo)愈傷組織

采用葉片、葉柄、根、莖和芽作為外植體，接入在1/2 MS +NAA 0.6 mg/L+6-BA 1 mg/L的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)40 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率結(jié)果見表3.

表3 不同外植體誘導(dǎo)愈傷組織結(jié)果

由表3可知，以上5種外植體中，僅有葉柄和莖能誘導(dǎo)出愈傷組織，而其他部位的外植體都未能成功誘導(dǎo)出愈傷組織.

通過觀察可知，各外植體接入培養(yǎng)基后，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，出現(xiàn)了各種不同的情況.首先根外植體在接入培養(yǎng)基4 d后就出現(xiàn)了褐化情況，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，根外植體褐化嚴(yán)重逐漸開始死亡；芽外植體接入培養(yǎng)基后，沒有出現(xiàn)愈傷化進(jìn)一步產(chǎn)生愈傷組織，而表現(xiàn)出明顯的抽芽現(xiàn)象；葉片接入培養(yǎng)基后，最初出現(xiàn)葉緣卷曲現(xiàn)象，但隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，葉片外植體變黃逐漸產(chǎn)生死亡；莖外植體在接入培養(yǎng)基13 d后，在莖著生葉的節(jié)處開始產(chǎn)生白色的愈傷組織，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，愈傷組織顏色由白色逐漸變?yōu)榫G色，培養(yǎng)40 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織的誘導(dǎo)率為20.3%；葉柄外植體在接入培養(yǎng)基10 d后，從葉柄的兩端開始膨大，培養(yǎng)40 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織的誘導(dǎo)率為32.5%.

2.2 不同激素配比對(duì)葉柄誘導(dǎo)愈傷組織的影響

在超凈工作臺(tái)上，將消毒后的金線蓮葉柄接入以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，添加了不同濃度的NAA、ZT 和6-BA 組成的三因素三水平培養(yǎng)基中，培養(yǎng)50 d后統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表4.

表4 不同激素配比誘導(dǎo)葉柄產(chǎn)生愈傷組織結(jié)果

由表4可知，不同濃度激素配比對(duì)葉柄愈傷組織誘導(dǎo)有明顯的影響作用.A8組培養(yǎng)基配方1/2 MS+NAA 0.6 mg/L+ZT 0.5 mg/L+6-BA 0.5 mg/L，在50 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率為95.0%，且產(chǎn)生的愈傷組織生長(zhǎng)速度快，質(zhì)地堅(jiān)硬，如圖1所示.

圖1 葉柄誘導(dǎo)愈傷組織

由極差分析可知， NAA的極差值為56.67，ZT的極差值為20.00，6-BA的極差值為18.33，由此可見NAA對(duì)葉柄誘導(dǎo)愈傷組織的影響最顯著，3個(gè)因素中影響最大的是NAA,其次是ZT，6-BA影響最小.3個(gè)因素的方差分析見表5.

表5 方差分析表

由表5可知，在研究的3個(gè)因素中，NAA的檢驗(yàn)值F=97.00，F(xiàn)0.05=19.00，F(xiàn)0.01=99.00，即F0.05F6-BA>FZT，即影響葉柄誘導(dǎo)愈傷組織最重要的因素是NAA，其次是6-BA，最后是ZT.

2.3 不同激素對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)分化不定芽的影響

選取葉柄誘導(dǎo)獲得的質(zhì)地緊致愈傷組織接入不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，30 d后統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表6.

由表6可知，不同激素配比對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)分化不定芽的影響效果不同.B9組培養(yǎng)基配方1/2 MS+ZT 0.4 mg/L+ NAA 0.5 mg/L+6-BA 1.5 mg/L是愈傷組織誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽的最佳培養(yǎng)基，30 d后統(tǒng)計(jì)不定芽的誘導(dǎo)率達(dá)93%.通過觀察發(fā)現(xiàn)，B9組培養(yǎng)基中生長(zhǎng)12 d后，在愈傷組織表面開始有黃白色的小芽產(chǎn)生，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，小芽逐漸長(zhǎng)大，顏色也由黃白色開始變?yōu)辄S綠色,培養(yǎng)30 d后小芽長(zhǎng)出嫩綠色的葉片，如圖2所示.

表6 不定芽誘導(dǎo)結(jié)果

圖2 不定芽誘導(dǎo)產(chǎn)生

由表6可知，ZT的極差值為38.66，NAA的極差值為10.67，6-BA的極差值為18.00，由此可見，ZT對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)分化不定芽的影響最顯著，3個(gè)因素影響大小依次是ZT>6-BA>NAA.3個(gè)因素的方差分析見表7.

表7 方差分析表

由表7可知，ZT的檢驗(yàn)值F=109.16，F(xiàn)0.01=99.00，檢驗(yàn)值F>F0.01，說明ZT對(duì)不定芽誘導(dǎo)有極顯著影響(P<0.01)；6-BA的檢驗(yàn)值F=19.70，F(xiàn)0.05=19.00，F(xiàn)0.01=99.00，即F0.05

綜合各因素的檢驗(yàn)值分析，可以得出對(duì)不定芽誘導(dǎo)最顯著的因素是ZT，其次是6-BA，此結(jié)果與極差分析結(jié)果一致.

2.4 不同激素對(duì)無根苗壯苗生根的影響

切取生長(zhǎng)1.5～2 cm的不定芽為無根苗，接入壯苗生根培養(yǎng)基中，30 d后統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表8.

表8 無根苗生根培養(yǎng)結(jié)果

由表8可知，C1(對(duì)照組)在培養(yǎng)基中不添加任何激素的情況下，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)生根率最低僅為43.3%，這說明在培養(yǎng)基中添加NAA和6-BA兩組激素對(duì)無根苗的壯苗生根具有不同程度的促進(jìn)作用.C3組(NAA濃度為0.3 mg/L)和C6組(6-BA濃度為0.3 mg/L)的生根率都是最高，分別為100%和93.3%，其中激素NAA對(duì)生根的促進(jìn)作用強(qiáng)于6-BA.

C3組不定芽接入培養(yǎng)基10 d后，在金線蓮無根苗的下部節(jié)處開始長(zhǎng)出帶有白色絨毛的不定根，并隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，不定根快速生長(zhǎng)，插入培養(yǎng)基中，其顏色也逐漸變?yōu)辄S綠色，如圖3所示.

圖3 培養(yǎng)基C3組培苗

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，金線蓮不定芽壯苗生根的最佳培養(yǎng)基是1/2 MS+活性炭1 g/L+NAA 0.3 mg/L，培養(yǎng)40 d統(tǒng)計(jì)生根率為100%，且組培苗長(zhǎng)勢(shì)健壯.

2.5 煉苗與移栽

何碧珠等[5]通過實(shí)驗(yàn)研究表明，金線蓮移栽時(shí)應(yīng)選用莖粗，具有2～4條根系且長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)良的植株，不但能有效提高植株對(duì)外界的適應(yīng)性，還能保證較高的成活率.本研究選取根和莖生長(zhǎng)健壯，并長(zhǎng)有3～5片葉，且苗高在4 cm以上的組培苗，用水沖洗掉根部的培養(yǎng)基后，移栽到裝有草炭泥和鋸末(1∶1)組成的育苗盆中，在溫度(20±2)℃，相對(duì)濕度在90%左右和光照強(qiáng)度為400 lx的條件下培養(yǎng).

在移栽25 d后，統(tǒng)計(jì)金線蓮苗的存活率為88%.金線蓮是典型的陰性植物，對(duì)其生長(zhǎng)的環(huán)境(如溫度與光照等)要求較高[6].在培育時(shí)，應(yīng)保持土壤適當(dāng)濕潤(rùn)，注意控制光照時(shí)間和強(qiáng)度.也有研究表明，為保證金線蓮組培苗的成活率和栽種成本，金線蓮在移栽時(shí)使用的基質(zhì)以樹皮最好，因其具有較好的透氣性、表面易干和成本低等優(yōu)點(diǎn)[7].

3 討 論

明代《本草綱目》記載，金線蓮全草可入藥，具清熱涼血、護(hù)肝、生津養(yǎng)顏、除濕解毒與扶正固本等功效.隨著近年來對(duì)其化學(xué)成分的研究，其藥理作用也逐漸得到科研人員的重視.經(jīng)大量研究發(fā)現(xiàn)，金線蓮的藥理作用包括抗腫瘤、降血糖、保肝、抗乙型肝炎病毒、免疫調(diào)節(jié)、降血壓、血管保護(hù)、抗感染和抗氧化等[8-9].

金線蓮不僅在醫(yī)療保健與美容行業(yè)等領(lǐng)域得到廣泛開發(fā)應(yīng)用，而且由于其株型小巧美觀，因此被人們當(dāng)成一種觀賞價(jià)值極高的觀葉珍品[10].為了解決金線蓮不斷擴(kuò)大的市場(chǎng)需求量，本研究利用生物工程技術(shù)，通過誘導(dǎo)金線蓮植物外植體脫分化和再分化形成不定芽和不定根過程，快速地培育出大量金線蓮優(yōu)質(zhì)種苗，建立金線蓮植物快速培養(yǎng)體系，解決了當(dāng)前金線蓮種苗嚴(yán)重短缺的問題，為金線蓮產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展提供了技術(shù)保障.