劉 菊 李廣存 段紹光 胡 軍 簡銀巧 劉建剛 金黎平 徐建飛

（中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部薯類作物生物學和遺傳育種重點實驗室，100081，北京）

馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）是繼水稻和小麥之后的世界第三大糧食作物[1]，對于保障世界糧食安全和推進中國從脫貧攻堅向鄉(xiāng)村振興平穩(wěn)過渡具有不可替代的作用。溫度是影響馬鈴薯植株生長和塊莖產(chǎn)量的最重要環(huán)境因素之一，馬鈴薯喜冷涼，高溫條件不僅會對植株營養(yǎng)生長造成明顯的傷害，還會影響塊莖形成進程[2]。通常情況下，馬鈴薯塊莖形成的最佳日間溫度為14℃～22℃[3]，日間環(huán)境溫度的持續(xù)升高將降低或完全抑制塊莖形成。研究[4]表明，日間高溫頻率和強度的不斷增加會對作物產(chǎn)量產(chǎn)生不利影響，而夜間高溫會對全球作物生產(chǎn)產(chǎn)生更嚴重的威脅。相比于日間溫度，馬鈴薯塊莖形成受夜間溫度影響更大[5-6]，尤其是夜間低溫促進塊莖發(fā)生，塊莖形成的最適夜間溫度是17℃[7]，夜間溫度高于20℃會降低植株結薯數(shù)，而夜間溫度一旦超過25℃，塊莖產(chǎn)量就會急劇下降[8]。研究[9]顯示，塊莖初始形成期，與日間高溫相比，夜間高溫通過影響植株的同化產(chǎn)物分配，顯著降低了大薯（＞100g）比例和早期收獲指數(shù)，造成產(chǎn)量的嚴重損失。

有研究[10]表明，馬鈴薯塊莖形成是一個非常復雜的生物學過程，涉及光周期、溫度、糖類物質(zhì)、糖轉運體和植物激素等相關基因和通路的協(xié)同作用。應用多組學技術研究發(fā)現(xiàn)，CO/FT（CONSTANS/FLOWERING LOCUS T）介導的光周期調(diào)控塊莖形成通路中，一些重要信號因子如StCO1、StGI（GIGANTEA）、StLHY（LATE ELONGATED HYPOCOTYL）、StCDF1（CYCLING DOF FACTOR 1）和StSP5G（SELF-PRUNING 5G）也同時響應溫度變化。作為塊莖形成的直接誘導者，F(xiàn)T類基因StSP6A同時參與光周期和溫度調(diào)控塊莖形成過程[11-12]。前人研究[12-14]已鑒定出，晝夜節(jié)律時鐘StTOC1（TIMING OF CAB EXPRESSION 1）、藍光受體蛋白StFKF1（FLAVIN-BINDING KELCH-REPEAT F-BOX 1）和microRNA SES等信號分子在高溫條件下，通過下調(diào)StSP6A的表達抑制結薯。然而，關于參與夜間溫度調(diào)控結薯相關的基因和分子調(diào)控機制尚不明確。

為進一步探究夜間溫度對馬鈴薯塊莖形成和發(fā)育的影響，本試驗以馬鈴薯試管薯為研究對象，通過比較不同夜間溫度處理下7個馬鈴薯品種或材料試管薯的形成情況和結薯時間受夜間溫度影響顯著材料的塊莖形成相關基因表達量的變化，探究最適試管薯形成的夜間溫度條件，并為篩選塊莖形成調(diào)控通路中響應夜間溫度變化的基因提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所馬鈴薯課題組種質(zhì)資源庫所保存的馬鈴薯‘DM（DM1-3 516 R44）’、‘RH（RH89-039-16）’、‘中薯3號’、‘中薯5號’、‘中薯18號’、‘中薯21號’和‘費烏瑞它（Favorita）’脫毒試管苗。試管苗繁殖所用培養(yǎng)基為MS固體培養(yǎng)基（30g/L蔗糖和7g/L瓊脂粉，pH 5.8），無菌條件下，剪取試管苗單個莖段接種于含50mL培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（容積350mL，高白料玻璃）中，每瓶接種12株，置于21℃±1℃培養(yǎng)箱中，光照強度2000lx，光周期16h/d條件下培養(yǎng)21d，獲得基礎苗。

1.2 試管薯誘導和處理條件

無菌條件下，以上述基礎苗為母苗，選取長勢一致且生長良好植株的第2～3節(jié)（從頂芽往下數(shù)）單個莖段，接種于結薯培養(yǎng)基（普通MS固體培養(yǎng)基添加蔗糖60g/L和瓊脂粉7g/L，pH 5.8），每節(jié)段含1個腋芽，每個基因型材料接種30瓶，每瓶接種6個莖節(jié)。將接種后的培養(yǎng)瓶分別置于日間/夜間溫度23℃/13℃、23℃/18℃和23℃/23℃的人工氣候箱（寧波江南儀器廠，型號GXZ-500D）進行試管薯誘導培養(yǎng)，每個基因型單個溫度處理下放置10瓶，共60株（20株/重復，重復3次），光照強度均為2000lx，光周期均為8h/d。

1.3 試管薯表型數(shù)據(jù)記錄

培養(yǎng)初期每隔3d觀察1次植株生長和試管薯形成情況，生長20d后每天觀察記錄表型變化和試管薯初始結薯時間，誘導培養(yǎng)60d時統(tǒng)計試管薯結薯率和結薯方式，具體統(tǒng)計方法如下：

試管薯初始結薯時間（d）：從接種之日到第1個試管薯初始形成（直徑約2mm）的天數(shù)[15]；試管薯結薯率（%）＝（結薯植株數(shù)/總植株數(shù)）×100；試管薯結薯方式包括3種類型，經(jīng)由匍匐莖頂端膨大形成的有柄薯（apical microtuber）；未經(jīng)匍匐莖發(fā)生，直接在腋芽基部膨大形成的無柄薯（basal microtuber）；在植株側枝腋芽處著生的無柄薯（medial microtuber），分類方法參照周俊[16]和Panteli?等[17]（圖 1）。

圖1 ‘RH’試管薯結薯方式示意圖Fig.1 Schematic diagram of types of in vitro tuberization in‘RH’

1.4 RT-qPCR取樣和相關基因表達分析

在23℃/23℃處理條件下，取‘RH’試管薯初始形成植株的葉片以及同時期23℃/23℃、23℃/18℃和23℃/13℃尚未有試管薯形成植株葉片，液氮處理后置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆茫?株葉片混樣為1個重復，每個處理重復3次。

按照多糖多酚植物總RNA快速提取試劑盒（GeneBetter）說明書提取RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，BioDrop uLite超微量蛋白核酸分析儀檢測RNA純度和濃度。獲得的RNA用反轉錄試劑盒Script III RT Kit With gDNA Eraser（GeneBetter）進行cDNA的合成，按照Hieff?qPCR SYBR? Green Master Mix（No Rox）（YEASEN）試劑盒說明進行RT-qPCR。在Light Cycler?480實時熒光定量PCR儀（Roche，瑞士）上完成反應，反應程序為：95℃預變性3min；95℃變性15s，60℃退火15s，72℃延伸20s，40個循環(huán)。用Primer 3.0（https://primer3.ut.ee/）設計引物，由北京六合華大基因科技有限公司合成，內(nèi)參基因EF1α及各基因引物序列見表1。

表1 實時定量PCR引物信息Table 1 RT-qPCR primer information

1.5 數(shù)據(jù)處理

運用Microsoft Excel 2019軟件處理數(shù)據(jù)并作圖，利用 SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析（ANOVA），選用 Duncan’s檢驗法對顯著性差異（P＜0.05）進行多重比較，采用 2-ΔΔCT法計算目的基因相對表達量。

2 結果與分析

2.1 不同夜間溫度處理對試管薯初始結薯時間的影響

供試材料試管薯初始結薯時間均受夜間溫度調(diào)控。3種溫度處理下，‘中薯5號’、‘中薯18號’和‘中薯21號’試管薯在23℃/18℃下結薯最早，而‘RH’、‘DM’、‘費烏瑞它’和‘中薯3號’在23℃/23℃下試管薯初始結薯時間最短。除‘費烏瑞它’和‘中薯5號’外，其余基因型試管薯在23℃/23℃和23℃/18℃下的初始結薯時間均顯著早于23℃/13℃處理（圖2）。對于‘RH’和‘DM’基因型，不同夜間溫度處理下的試管薯初始結薯時間差異顯著。以上結果表明，塊莖初始結薯時間受夜間溫度影響，過低的夜間溫度不利于塊莖形成。

圖2 不同夜間溫度處理對試管薯初始結薯時間的影響Fig.2 Effects on initiation of in vitro tuberization under different night temperature treatments

2.2 不同夜間溫度處理對試管薯結薯率的影響

不同夜間溫度處理下，供試材料試管薯的結薯能力不同（圖3）。隨夜間溫度升高，‘費烏瑞它’、‘中薯5號’、‘中薯18號’和‘中薯21號’試管薯結薯率呈先上升后下降的趨勢，在23℃/18℃條件下結薯率最高?！甊H’和‘中薯3號’試管薯結薯率變化趨勢基本一致，即23℃/18℃和23℃/13℃條件下的試管薯結薯率顯著高于23℃/23℃處理，本試驗中，‘DM’基因型在3種夜間溫度處理下的試管薯結薯率無顯著差異。以上結果表明，夜間高溫處理會降低試管薯結薯率。

圖3 不同夜間溫度處理對試管薯結薯率的影響Fig.3 Effects on percentage of in vitro tuberization under different night temperature treatments

2.3 不同夜間溫度處理對試管薯結薯方式的影響

在3種夜間溫度處理下，大多數(shù)供試材料試管薯的結薯方式固定，試管薯多以有柄薯的形式存在，而‘RH’和‘中薯18號’試管薯結薯方式受夜間溫度影響而發(fā)生變化（圖4），隨著夜間溫度的升高，無柄薯的比例逐漸增加，其中‘中薯18號’在23℃/23℃處理下，存在較高比例基生無柄薯，這表明‘RH’和‘中薯18號’植株在夜間溫度升高環(huán)境下更傾向于不經(jīng)由匍匐莖伸長而直接在莖節(jié)腋芽處膨大形成試管薯。

圖4 不同夜間溫度處理對試管薯結薯方式的影響Fig.4 Effects on type of in vitro tuberization under different night temperature treatments

2.4 不同夜間溫度處理下塊莖形成相關基因的表達分析

選取參與馬鈴薯塊莖形成的光受體基因（StFKF1）、生物鐘相關基因（StELF4和StTOC1）、CO/FT光周期調(diào)控通路關鍵基因（StCO1和StSP6A）以及糖代謝和糖轉運體調(diào)控相關基因（StSWEET1和StSEX4）進行不同夜間溫度條件下結薯植株和非結薯植株的表達分析（圖5）。

圖5 不同夜間溫度處理下塊莖形成相關基因表達量的分析Fig.5 Expression analysis of tuberization related genes under different day/night temperature treatments

以結薯最早的23℃/23℃處理下結薯植株葉片中基因表達水平為對照，結果表明，3種溫度處理下的非結薯植株與對照相比，StFKF1在23℃/18℃和23℃/13℃處理下的表達量顯著上升，而StSEX4在23℃/18℃和23℃/13℃處理下的表達量顯著下降。StTOC1和StCO1僅在23℃/13℃處理下的表達量顯著升高，其他處理與對照無顯著差異。StELF4在3種溫度條件下均顯著下調(diào)表達，與之相反，StSP6A和StSWEET1的表達均顯著上調(diào)。

通過對3種夜間溫度處理下的非結薯植株葉片基因表達變化分析發(fā)現(xiàn)，隨著夜間溫度降低，StFKF1表達量顯著增加，23℃/13℃條件下最高；StELF4表達量在23℃/18℃和23℃/13℃之間差異顯著；StCO1表達量在23℃/23℃和23℃/13℃條件下差異顯著；StSEX4表達量在23℃/23℃和23℃/18℃條件下差異顯著；StTOC1和StSP6A表達量的顯著性變化趨勢相同，23℃/23℃和23℃/18℃處理間無顯著差異，但均顯著低于23℃/13℃處理；StSWEET1在23℃/23℃條件下表達量顯著低于其他2種溫度處理。

3 討論

3.1 不同夜間溫度處理對試管薯初始結薯時間和結薯率的影響

溫度是影響馬鈴薯塊莖形成和發(fā)育的重要環(huán)境因子，與日間溫度相比，夜間溫度對馬鈴薯的生長和產(chǎn)量建成有更重要的影響[2]。夜間溫度尤其是夜間高溫對水稻和小麥植株農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量等均有不利影響[18-19]。馬鈴薯試管薯研究表明，環(huán)境溫度過高或過低都不利于塊莖形成，15℃～18℃最適宜試管薯的誘導培養(yǎng)[20]，適度低溫（17±1）℃培養(yǎng)的試管薯始薯期變短，結薯數(shù)增多[21]。本試驗中，23℃/18℃處理下絕大多數(shù)供試基因型試管薯初始結薯時間顯著早于23℃/13℃處理，且23℃/18℃下的試管薯結薯率較高，該結果與張武等[22]和邱甜等[23]研究結果一致。前人研究[24]發(fā)現(xiàn)，在誘導結薯時不同馬鈴薯品種對溫度的適應性不同，炸片加工品種‘大西洋’和彩色薯肉品種‘轉心烏’試管薯的最佳誘導溫度分別為20℃和25℃。本試驗中，‘RH’和‘DM’等材料試管薯在23℃/23℃下結薯最早，而‘中薯5號’和‘中薯18號’等在23℃/18℃下結薯最早，表明不同基因型馬鈴薯試管薯形成對夜間溫度的敏感性不同。由此可見，夜間溫度對馬鈴薯試管薯形成存在顯著影響，適宜的夜間溫度可以縮短塊莖初始形成時間和提高結薯率，過高或過低的夜間溫度都不利于試管薯形成。

3.2 不同夜間溫度處理對塊莖形成相關基因表達的影響

溫度會對晝夜節(jié)律時鐘基因的轉錄水平產(chǎn)生影響。擬南芥中，環(huán)境溫度影響生物鐘基因TOC1、GI、CCA1和LHY等的表達[25]。對馬鈴薯的研究表明，與22℃相比，30℃條件下葉片中StTOC1表達升高[26]，StTOC1是塊莖形成的負調(diào)節(jié)因子，下調(diào)StTOC1的表達可以減輕高溫對馬鈴薯產(chǎn)量的不利影響[13]。本試驗中，夜間23℃和18℃處理下，結薯與非結薯植株間葉片StTOC1表達量無顯著差異，但夜間13℃時，非結薯植株葉片StTOC1表達水平顯著升高，表明該溫度下，StTOC1顯著抑制塊莖形成，這與夜間13℃下試管薯初始結薯時間最晚的表型結果相符。高氣溫環(huán)境下，馬鈴薯葉片生物鐘基因StELF4表達量降低[14]。本試驗結果表明，在非結薯植株中，夜間低溫能夠降低StELF4的表達量。

溫度會影響糖代謝相關基因的表達。研究[14]發(fā)現(xiàn)，與22℃/20℃處理相比，29℃/27℃處理下的塊莖中蔗糖外排載體蛋白StSWEET1和塊莖中淀粉降解相關基因StSEX4的表達量均顯著降低，阻止了蔗糖向質(zhì)外體泄漏，減少了高溫下塊莖中的淀粉含量損失。馬鈴薯葉片生成的光合產(chǎn)物主要以蔗糖形式經(jīng)韌皮部運輸至塊莖[27-28]。本試驗中，低溫條件下，非結薯植株葉片中StSEX4表達下調(diào)，而StSWEET1表達量顯著上升，有助于葉片中的淀粉積累和同化產(chǎn)物向塊莖轉運。

CO/FT介導的光周期調(diào)控通路在馬鈴薯塊莖形成過程中發(fā)揮著重要作用。擬南芥中，AtCO（Arabidopsis CONSTANS）的轉錄調(diào)控是光周期調(diào)控決定花期的重要因素[29]，同樣CO類轉錄因子StCO影響馬鈴薯塊莖結薯時間，長日照（或者短日照加暗間斷）下StCO沉默株系結薯提早[30]。StCO在塊莖形成過程中同樣響應溫度變化，在馬鈴薯熱敏感品種Kufri Chandramukhi和耐熱品種Kufri Surya的塊莖形成期進行晝/夜24℃/20℃和24℃/24℃處理，結果發(fā)現(xiàn)，處理14d后，2個品種在高溫條件下葉片StCO表達量均顯著高于適溫處理[31]。本試驗中，23℃/13℃處理下的非結薯植株葉片StCO表達量顯著高于其他處理，這也印證了StCO在溫度調(diào)控結薯時間上起抑制作用[26]。

馬鈴薯FT家族基因StSP6A在塊莖形成過程中發(fā)揮重要作用。短日照條件下，葉片產(chǎn)生的StSP6A轉運蛋白通過韌皮部運輸?shù)劫橘肭o頂端誘導塊莖形成[11]。Lehretz等[12]研究揭示了高溫條件下，miRNA（SES）通過下調(diào)StSP6A表達抑制結薯。StSP6A轉錄水平受溫度調(diào)控已在許多研究[32]中得到證明。馬鈴薯葉片中StFKF1表達量受土壤高溫影響較大，高溫環(huán)境可通過下調(diào)StFKF1的表達，從而降低StSP6A含量而使結薯受阻[14]。本試驗結果表明，StFKF1和StSP6A表達量受夜間溫度調(diào)控，夜間13℃下，StFKF1和StSP6A表達量均顯著高于其他處理，推測這可能是因為對于非結薯植株來說，由于處于即將形成試管薯的準備過程，夜間低溫刺激了葉片StSP6A的表達，從而導致23℃/23℃處理下的已結薯植株葉片StSFKF1和StSP6A的表達量相對較低，關于StSP6A在不同夜間溫度下調(diào)控試管薯形成的機制還有待深入研究。

4 結論

夜間低溫（13℃）會延緩馬鈴薯試管薯初始結薯時間，夜間高溫（23℃）降低試管薯結薯率，而夜間適溫（18℃）可促進試管薯形成。生物鐘基因StTOC1和StELF4、糖代謝相關基因StSWEET1和StSEX4及光周期通路基因StFKF1、StCO和StSP6A均表現(xiàn)出顯著的溫度響應變化，表明夜間溫度可通過影響多種代謝途徑基因的表達調(diào)控塊莖形成過程。