李毅 張玉潔

摘 要：為快速準(zhǔn)確大批量檢測(cè)速凍調(diào)理肉制品中6種喹諾酮類殘留量，采用5%甲酸的乙腈溶液提取，ProElut QuE 2 mL Tube進(jìn)行快速凈化，過(guò)膜進(jìn)超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜儀分析。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，6種喹諾酮類的線性相關(guān)系數(shù)均在0.99以上，其中恩諾沙星平均回收率為98.4%～104.2%，環(huán)丙沙星平均回收率為79.8%～101.4%，氧氟沙星平均回收率為86.0%～106.5%，培氟沙星平均回收率為78.5%～87.0%，諾氟沙星平均回收率為82.0%～99.3%，洛美沙星平均回收率為86.1%～95.2%。結(jié)果表明，該方法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確，適用于速凍調(diào)理肉制品中6種喹諾酮類藥物殘留量的測(cè)定。

關(guān)鍵詞：喹諾酮類;QuEChERS;速凍調(diào)理肉制品

Determination of 6 Quinolones Residues in Quick-Frozen Conditioned Meat Products by Quechers Ultra-High Performance Liquid Chromatography Tandem?Mass Spectrometry

LI Yi1， ZHANG Yujie2

（1.Shandong Zhongzhun Testing Technology Co.， Ltd.， Weihai 264209， China; 2.Weihai Institute of Food and Drug Inspection and Testing， Weihai 264209， China）

Abstract： In order to quickly and accurately detect the residues of 6 quinolones in quick-frozen conditioned meat products in large quantities， 5% formic acid in acetonitrile solution was used for extraction， and ProElut QuE?2 mL Tube was used for rapid purification. It was verified by experiments that the linear correlation coefficients of the six quinolones were all above 0.99， among which the average recovery rate of enrofloxacin was 98.4%～104.2% the average recovery rate of ciprofloxacin was 79.8%～101.4%， and the average recovery rate of ofloxacin was 86.0%～106.5%， the average recovery rate of pefloxacin was 78.5%～87.0%， the average recovery rate of norfloxacin was 82.0%～99.3%， and the average recovery rate of lomefloxacin was 86.1%～95.2%. The results showed that the method was simple， rapid and accurate， and was suitable for the determination of 6 quinolones residues in quick-frozen conditioned meat products.

Keywords： quinolones; QuEChERS; quick frozen conditioned meat products

隨著人們生活節(jié)奏的加快，生存壓力的增大，速凍調(diào)理肉制品以其方便快捷、簡(jiǎn)單易操作的優(yōu)勢(shì)特點(diǎn)進(jìn)入人們的餐桌并逐步占據(jù)主導(dǎo)。速凍調(diào)理肉制品是指以畜禽肉為主要原料，經(jīng)攪拌、調(diào)味等工藝加工而成的非即食類肉制品。

喹諾酮類抗生素作為廣譜抗菌藥物，廣泛用于革蘭陰性細(xì)菌感染的治療，由于價(jià)格低且藥效明顯而廣泛應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖[1]。喹諾酮類等獸藥的安全合理使用，可以降低畜禽發(fā)病率與死亡率，促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)，但部分養(yǎng)殖戶過(guò)分追求經(jīng)濟(jì)利益、盲目加大用藥，導(dǎo)致藥物在畜禽體內(nèi)富集，人食用此類動(dòng)物組織后，造成人體疾病或?qū)λ幬锂a(chǎn)生耐藥性，長(zhǎng)期攝入可能引起食用者惡心、嘔吐、疼痛等胃腸道不適及腸道菌群失調(diào)[2];也會(huì)引起頭痛、頭暈、睡眠不良等癥狀[3];并有潛在的致癌、致畸、致突變風(fēng)險(xiǎn)。因此，喹諾酮類藥物殘留問(wèn)題越來(lái)越引起人們的關(guān)注。美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局于2005年宣布禁止用于治療家禽細(xì)菌感染的抗菌藥物恩諾沙星的銷售和使用。我國(guó)也在GB 31650—2019中規(guī)定環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、培氟沙星、諾氟沙星和洛美沙星等6種喹諾酮類藥物在動(dòng)物肌肉組織中的最高殘留限量為10～500 μg/kg。

喹諾酮類藥物在動(dòng)物組織中的殘留分析方法主要有酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法、高效液相色譜法和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析法。傳統(tǒng)方法多采用液液萃取法或者固相萃取法，液液萃取法浪費(fèi)溶劑，準(zhǔn)確度低，若提取溶劑中含有乙腈，旋蒸容易報(bào)廢且最終會(huì)有水分殘留，影響最終的定量分析結(jié)果;固相萃取法需要經(jīng)過(guò)活化、上樣、淋洗、洗脫和氮吹等諸多步驟，消耗時(shí)間太長(zhǎng)，大批量檢測(cè)樣品時(shí)會(huì)降低工作效率。本方法基于QuEChERS原理，采用快速過(guò)濾柱對(duì)樣品提取液進(jìn)行凈化。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

乙腈（CH3CN），色譜純，美國(guó)FISHER公司;甲酸（CH3COOH），色譜純，上海麥克林生化科技有限公司;恩諾沙星（Enrofloxacin），壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司;環(huán)丙沙星（Ciprofloxacin），壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司;氧氟沙星（Ofloxacin），壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司;培氟沙星（Pefloxacin），壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司;諾氟沙星（Norfloxacin），壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司;洛美沙星（Lomefloxacin），壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司。6FDA8BEF-9993-46BB-B3EF-B00D1A7FA1E9

1.2 儀器與設(shè)備

AB 3500液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，配電噴霧離子源，美國(guó)AB SCIEX公司;SQP電子天平，美國(guó)Sartorius公司;超純水機(jī)，法國(guó)Millipore公司;移液槍，美國(guó)Sartorius公司;高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司;超聲波清洗器，昆山美美超聲儀器有限公司;渦旋混合器，德國(guó)IKA公司;色譜柱：Kinetex C18 100 mm×2.1 mm×2.6 μm。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取粉碎均勻的速凍牛排樣品5.00 g置于50 mL離心管中，加入含5%甲酸的乙腈溶液10 mL，渦旋混合，15 ℃超聲15 min。加入2 g氯化鈉，渦旋混合90 s，以轉(zhuǎn)速8 500 r/min，溫度2 ℃，冷凍離心10 min，取1 mL上清液待凈化。將1 mL提取液轉(zhuǎn)移到ProElut QuE 2mL Tube，渦旋30 s，離心后取上清液，加水100 μL，渦旋混合，氮吹至近干，加乙腈-0.1%甲酸水（1∶9）定容至1 mL，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，進(jìn)液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀分析。

1.3.2 儀器條件

（1）色譜條件。流動(dòng)相：A 0.1%甲酸溶液，B 乙腈，梯度洗脫，見(jiàn)表1;流速：0.3 mL/min;柱溫：40 ℃;進(jìn)樣量：5 ?L。

（2）質(zhì)譜條件。離子源：電噴霧（ESI）離子源;掃描方式：正離子掃描;檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè);電離電壓：3 000 V;源溫：100 ℃;霧化溫度：350 ℃;錐孔氣流速：25 L/h;霧化氣流速：450 L/h。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在參考GB/T 21312—2007[4]、農(nóng)業(yè)部1077號(hào)公告—1—2008[5]的基礎(chǔ)上，首先對(duì)質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，以離子豐度比較大且干擾較小為原則，選擇適合的子離子，同時(shí)以豐度值較大的子離子作為定量離子。采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行分析，表2為該方法獲得的最佳質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)，圖1為特征峰。

在優(yōu)化質(zhì)譜條件的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步優(yōu)化了流動(dòng)相比例，最終確定在正離子模式下，以乙腈和0.1%甲酸水為流動(dòng)相，6種喹諾酮類藥物能夠在10 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)色譜分離，且互不干擾。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線和檢出限

標(biāo)準(zhǔn)貯備液：取喹諾酮類標(biāo)準(zhǔn)品各約100 μL于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，配制成濃度為1 mg/L的喹諾酮類標(biāo)準(zhǔn)貯備液，-20 ℃保存，有效期3個(gè)月。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：取喹諾酮類標(biāo)準(zhǔn)貯備液各1 mL于10 mL棕色量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配制成濃度均為100 ng/mL混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：取20 μL、50 μL、100 μL、200 μL和400 μL混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，用流動(dòng)相稀釋至1 mL配制成濃度為2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL和40 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。以特征離子質(zhì)量色譜峰面積比為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。所得線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表3。

將100 ng/mL混合標(biāo)準(zhǔn)工作液稀釋至1.00 ng/mL、2.50 ng/mL、5.00 ng/mL后依次添加至樣品中，按照上述實(shí)驗(yàn)操作進(jìn)行測(cè)定，以3倍信噪比計(jì)算檢出限，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.3 精密度

對(duì)實(shí)驗(yàn)操作樣品進(jìn)行了方法精密度試驗(yàn)，用來(lái)保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性，用加標(biāo)濃度為5.00 ng/mL的喹諾酮類樣品，重復(fù)檢測(cè)6次，結(jié)果精密度如表4所示。

2.4 回收試驗(yàn)

按照上述實(shí)驗(yàn)步驟對(duì)速凍牛排制品進(jìn)行了3個(gè)不同濃度（2.50 ng/mL、5.00 ng/mL、10.00 ng/mL）的加標(biāo)回收試驗(yàn)，計(jì)算出以下6種喹諾酮類藥物的回收率，結(jié)果見(jiàn)表5。

3 結(jié)論

經(jīng)多次試驗(yàn)驗(yàn)證，本實(shí)驗(yàn)采用的ProElut QuE?2 mL Tube快速凈化技術(shù)結(jié)合超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法成功解決了檢測(cè)大批量樣品喹諾酮時(shí)面對(duì)的時(shí)效長(zhǎng)、準(zhǔn)確度低的問(wèn)題，對(duì)速凍調(diào)理肉制品中喹諾酮類藥物殘留的測(cè)定具有重要意義。

參考文獻(xiàn)

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