王詩琳 于玲莉 成殷

摘 要 細胞和基因治療產(chǎn)品是個體化產(chǎn)品，產(chǎn)量小、效期短，無菌檢查需采用快速檢查法。本文介紹細胞和基因治療產(chǎn)品的快速無菌檢查方法及其制造商在實際應(yīng)用過程中可能會遇到的主要問題，供業(yè)界和監(jiān)管部門參考。

關(guān)鍵詞 細胞治療 快速微生物檢查 無菌

中圖分類號：R951； R927.1 文獻標(biāo)志碼：C 文章編號：1006-1533（2022）11-0014-03

引用本文 王詩琳， 于玲莉， 成殷. 快速無菌檢查方法在細胞和基因治療產(chǎn)品中的應(yīng)用及監(jiān)管概述[J]. 上海醫(yī)藥， 2022， 43（11）： 14-16； 35.

Application and regulation of rapid sterility test in cell and gene therapy products

WANG Shilin， YU Lingli， CHENG Yin

（Shanghai Center for Drug Evaluation and Inspection， Shanghai 201203， China）

ABSTRACT Cell and gene therapy products are individualized products with low yield and short shelf life. Rapid test is needed for sterility test. This article introduces the rapid sterility test of cell and gene therapy products and the main problems that the manufacturers may encounter in the actual application process so as to provide reference for the industry and regulatory authorities.

KEY WORDS cell therapy； rapid microbial examination； sterility

細胞和基因治療產(chǎn)品是個體化產(chǎn)品，產(chǎn)量小、效期短，無菌檢查需采用快速檢查法。本文介紹細胞和基因治療產(chǎn)品的快速無菌檢查方法及其制造商在實際應(yīng)用過程中可能會遇到的主要問題，供業(yè)界和監(jiān)管部門參考。

1 細胞和基因治療產(chǎn)品

在我國，細胞治療產(chǎn)品不包含輸血用血液成分、未經(jīng)體外處理的移植用造血干細胞、生殖相關(guān)細胞，以及由細胞組成的組織、器官類產(chǎn)品等[1]。

2 快速無菌檢查方法

快速無菌檢查方法包括三磷酸腺苷生物發(fā)光成像法、流式細胞術(shù)法、等溫微量熱法、實時定量核酸擴增法、基于呼吸作用的無菌檢測方法、固相細胞計數(shù)法[2]、同源序列核酸擴增法[3]、羧基熒光素二醋酸酯和4， 6-二脒基-2-苯基吲哚雙染色熒光計數(shù)法[4]等（表1）。

目前，對細胞和基因治療產(chǎn)品的快速無菌檢查主要采用商業(yè)化的儀器或設(shè)備進行，其中以基于呼吸作用的無菌檢測方法最常用，所用技術(shù)主要包括：①基于二氧化碳底物顯色的檢測技術(shù)。通過儀器配套的專用培養(yǎng)瓶進行微生物培養(yǎng)，微生物增殖后產(chǎn)生的二氧化碳引起瓶內(nèi)H+濃度變化，瓶底的顯色硅膠感應(yīng)器與H+結(jié)合而發(fā)生顏色變化，從而被儀器檢測和記錄。②基于熒光增強顯示的檢測技術(shù)。通過儀器配套的專用培養(yǎng)瓶進行微生物培養(yǎng)，微生物增殖后產(chǎn)生的二氧化碳引起瓶底熒光底物的光強度和波長變化，從而被儀器檢測和記錄。

3 國內(nèi)外對細胞和基因治療產(chǎn)品快速無菌檢查法的監(jiān)管要求

3.1 國內(nèi)監(jiān)管要求

2021年10月國家藥典委員會公布的《細胞類制品微生物檢查法草案擬公示稿》[5]中指出，采用快速微生物檢查法進行細胞類制品放行檢查，應(yīng)充分考慮細胞類制品的生產(chǎn)工藝、無菌保障水平、微生物污染風(fēng)險和使用者的獲益風(fēng)險比等因素，基于風(fēng)險有條件地施行。

2022年1月，國家藥品監(jiān)督管理局公布了《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范-細胞治療產(chǎn)品附錄（征求意見稿）》[6]，對細胞治療產(chǎn)品從供者物料的運輸、接收，產(chǎn)品的生產(chǎn)、檢驗，到成品的放行、儲存和運輸?shù)娜^程提出了質(zhì)量控制的要求。

3.2 國外監(jiān)管法規(guī)

美國藥典42版-國家處方集37版通則<1071>《短效期產(chǎn)品放行的快速微生物檢查：依據(jù)風(fēng)險評估的方法》[2]中指出，快速微生物檢查應(yīng)基于風(fēng)險評估施行，其可用于中間過程控制，作為獲得無菌結(jié)果和對污染及早發(fā)現(xiàn)、及早控制的手段。

歐盟藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范附錄2《人用生物原料藥和藥品的生產(chǎn)》[7]中指出，對于短效期和終產(chǎn)品需要提前進行批認(rèn)證的生物藥品，應(yīng)考慮采用其他等效的方法，包括快速微生物檢查法?？稍趦蓚€或多個階段進行批認(rèn)證和放行。

3.3 驗證要求

在以快速無菌檢查法替代現(xiàn)行中國藥典的無菌檢查方法前，制造商必須開展快速無菌檢查法替代中國藥典無菌檢查方法的驗證工作，定性驗證參數(shù)包括專屬性、檢測限、耐用性、重現(xiàn)性等。制造商可參考中國藥典2020年版通則9201[8]、美國藥典40版-國家處方集35版通則<1223>[9]、歐洲藥典9.2版通則5.1.6[10]、歐洲藥典10.3版通則2.6.27[11]和美國注射劑協(xié)會第33號技術(shù)報告[12]等中的相關(guān)要求開展驗證（表2）。須確認(rèn)快速無菌檢查法的應(yīng)用效果優(yōu)于或至少等同于傳統(tǒng)無菌檢查法。A636CD05-F3BB-4D7F-830D-328A56D78017

4 制造商在應(yīng)用快速無菌檢查方法過程中遇到的主要問題

細胞和基因治療產(chǎn)品的制造商在應(yīng)用快速無菌檢查方法的過程中會遇到各種問題，概括起來主要包括以下幾項。

1）樣品成本

中國藥典2020年版通則9201[8]中指出，替代方法學(xué)驗證參數(shù)應(yīng)包括專屬性、檢測限、耐用性和重現(xiàn)性。驗證試驗需要使用大量的樣品，而細胞和基因治療產(chǎn)品的產(chǎn)量極小且成本極高，傳統(tǒng)的無菌檢查法的取樣方案并不適用。中國藥典要求盡量使用產(chǎn)品進行無菌檢查，但因其單次產(chǎn)量極小，現(xiàn)階段也接受具有代表性的供試品，如在生產(chǎn)過程中不同的點取樣和最終制劑取樣的檢查方案[13]。

2）菌株濃度

中國藥典2020年版通則9201[8]中指出，檢測限試驗中接種的試驗菌為每單位不超過5 CFU，以達到接種后采用中國藥典方法在50%的樣品中即可檢出該試驗菌的效果。因此，檢測限試驗中通常需要設(shè)置極低的菌株濃度，如每單位不超過2 CFU，但實際上很難配制恰好符合要求的菌株濃度。此外，當(dāng)菌株濃度極低時，使用胰酪大豆胨瓊脂平皿培養(yǎng)的需氧菌計數(shù)結(jié)果可能不準(zhǔn)確。為了覆蓋試驗所需菌株濃度，通常需要進行多梯度稀釋，而這會增加樣品的損耗。目前少有商業(yè)化的適用于檢測限驗證的各種固定濃度的菌株，通常需要制造商自己配制。

3）取樣量

中國藥典2020年版通則9201[8]中并未提及快速無菌檢查方法驗證的樣品接種量，而其實際接種量有別于傳統(tǒng)的無菌檢查法，制造商一般會參照國外藥典的要求設(shè)置接種量。驗證時每份培養(yǎng)基的產(chǎn)品接種量應(yīng)與產(chǎn)品放行時的快速無菌檢查法一致。對于單個容器且總體積在1 ～ 1 000 mL的單一批次細胞治療產(chǎn)品，接入每份培養(yǎng)基的產(chǎn)品量有一定的要求（表3）[11]。

4）放行策略

制造商必須對快速無菌檢查法和傳統(tǒng)的無菌檢查法進行比較和評估，必要時同步進行相互的驗證[14]。在兩法平行施行期間，應(yīng)以現(xiàn)行中國藥典規(guī)定的無菌檢查法檢查結(jié)果為產(chǎn)品無菌檢查的最終判定依據(jù)。應(yīng)關(guān)注兩法檢查結(jié)果不一致的供試品，對檢查過程進行充分的調(diào)查。

5）方法的再確認(rèn)或再驗證

為保證快速無菌檢查方法在供試品無菌檢查過程中的適用性，應(yīng)關(guān)注生產(chǎn)和檢查過程中可能對方法適用性有影響的因素的變更或變化，如生產(chǎn)工藝變更、無菌檢查方法修訂、供試品變更等。應(yīng)評估這些變更或變化是否會影響快速無菌檢查方法的靈敏度、重現(xiàn)性等，并依據(jù)評估結(jié)果對方法進行全面或部分的再確認(rèn)或再驗證[15]。

5 結(jié)語

細胞和基因治療產(chǎn)品產(chǎn)量小、效期短的特點決定了對該類產(chǎn)品施行快速無菌檢查法是必要的。不過，目前國內(nèi)制造商進行快速無菌檢查法方法學(xué)驗證的難度不小，須解決技術(shù)上的難題，積累足夠的驗證試驗數(shù)據(jù)，為縮短快速無菌檢查法與現(xiàn)行中國藥典無菌檢查法的平行施行期打下基礎(chǔ)，并與監(jiān)管部門一起共同促進細胞和基因治療產(chǎn)品相關(guān)法規(guī)體系的升級，保障人民的生命健康和用藥安全。

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