邢瑩，普程偉，尚柯，屈晨雪

中性脂肪 沉 積 癥（neutral lipid storage disease，NLsD）是一種罕見(jiàn)的常染色體隱性遺傳病，主要由脂肪代謝途徑中的酶或輔基缺陷導(dǎo)致三酰甘油（triglyceride，TG）在不同組織細(xì)胞內(nèi)異常沉積引起。依據(jù)臨床表現(xiàn)和突變基因不同可將NLsD 分為中性脂肪沉積癥伴肌?。╪eutral lipid storage disease with myopathy，NLsDM）和中性脂肪沉積癥伴魚(yú)鱗?。╪eutral lipid storage disease with ichthyosis，NLsDI）[1]。 前 者 是 由于 patatin樣磷酸酯酶結(jié)構(gòu)域蛋白 2（patatin-like phospholipase domain-containing protein 2，PNPLA2）基因發(fā)生突變導(dǎo)致，主要臨床表現(xiàn)為骨骼肌或心肌損害癥狀[2]；后者的致病基因是比較基因識(shí)別 -58（comparative gene identification-58，CGI-58），又稱含α/β水解酶結(jié)構(gòu)域蛋白5（α/βhydrolase domain-containing protein 5，ABHD5），主要臨床表現(xiàn)為魚(yú)鱗病，又稱為Dorfman-chanarin綜合征[3]。NLsD發(fā)病率低、臨床表現(xiàn)缺乏特異性、患者可就診于多個(gè)不同科室，部分患者伴有實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果異常如高脂血癥、高肌酸激酶（creatinine kinase，CK）、肝功能異常等，肌肉病理檢查可見(jiàn)肌纖維內(nèi)大量脂肪沉積。但是以上檢查均不具有特異性，明確診斷仍有賴于基因檢測(cè)，很多患者因沒(méi)有及時(shí)進(jìn)行基因檢測(cè)而延誤了診斷和治療。NLsD患者外周血涂片可見(jiàn)中性粒細(xì)胞胞質(zhì)中存在大量空泡（瑞-姬氏染色），經(jīng)油紅O染色證實(shí)為脂肪沉積有較高的診斷價(jià)值，但油紅O染色操作復(fù)雜，不適合常規(guī)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展。因此，本研究將3例NLsDM患者的外周血涂片采用多種方法進(jìn)行染色，旨在找到更為便捷的染色方法，為NLsDM的及時(shí)診斷提供參考依據(jù)。

1 病例簡(jiǎn)介

病例1，女性，36歲。因肌肉無(wú)力于2021年6月就診于北京大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科?；颊唠p上肢肌無(wú)力2年余，右側(cè)為著，雙上肢肌肉萎縮；無(wú)聽(tīng)力下降及心功能下降；家族史：父母無(wú)近親結(jié)婚史，父母和弟弟均無(wú)類似癥狀；祖籍武漢；實(shí)驗(yàn)室檢查：血清CK及TG水平升高；肌電圖（EMG）：雙上肢肌源性損害；肌肉活檢：可見(jiàn)脂質(zhì)沉積；基因檢測(cè)：患者PNPLA2基因純合變異（c.757+1G＞T），家人未做基因檢測(cè)?；颊咴\斷為NLsDM，建議服用非諾貝特降低血脂以及中鏈脂肪酸飲食。

病例2，男性，27歲。8年前出現(xiàn)四肢無(wú)力，雙下肢近、遠(yuǎn)端肌肉萎縮，且逐漸加重，目前行動(dòng)困難；無(wú)聽(tīng)力下降及心功能下降；未做肌電圖及肌肉活檢；于2021年7月就診于北京大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科。家族史：父母無(wú)近親結(jié)婚史、無(wú)類似癥狀，姐姐存在肌無(wú)力癥狀和聽(tīng)力下降。實(shí)驗(yàn)室檢查：血清TG和CK水平均增高。基因檢測(cè)：父母均存在PNPLA2基因雜合變異（c.757+1G＞T），患者和姐姐該位點(diǎn)存在純合變異，診斷為NLsDM，治療方案同病例1。

病例3，男性，38歲。5年前感覺(jué)雙腿易疲勞，上樓時(shí)無(wú)力，天冷時(shí)明顯；2年前出現(xiàn)雙耳聽(tīng)力下降，雙腿無(wú)力加重，目前無(wú)法上樓；于2021年8月就診于北京大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科。家族史：父母近親結(jié)婚（奶奶和姥姥是親姐妹），無(wú)類似癥狀；哥哥患強(qiáng)直性脊柱炎，無(wú)聽(tīng)力問(wèn)題。實(shí)驗(yàn)室檢查：血清TG和CK水平均增高。基因檢測(cè)：患者父母均存在PNPLA2基因雜合變異（c.703C＞T），患者該位點(diǎn)存在純合變異，診斷為NLsDM，治療方案同病例1。

本文價(jià)值：

（1）本文首次提出外周血細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查在及時(shí)診斷中性脂肪沉積癥伴肌?。∟LsDM）中的重要價(jià)值，以往的研究多集中于肌肉活檢、基因檢測(cè)等，但肌肉活檢為有創(chuàng)檢查，患者依從性差，而基因檢測(cè)尚沒(méi)有在臨床廣泛開(kāi)展。外周血細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查操作方便，簡(jiǎn)單易行，不需要額外檢測(cè)設(shè)備，在基層醫(yī)院均可開(kāi)展，可作為篩查NLsDM的常規(guī)方法。（2）由于NLsDM非常罕見(jiàn)，本研究納入病例數(shù)較少，需要在今后的工作中繼續(xù)積累。

2 NLSDM患者外周血細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn)

采用瑞-姬氏染色觀察患者外周血白細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)：中性粒細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞、嗜堿粒細(xì)胞及單核細(xì)胞胞質(zhì)中均可見(jiàn)數(shù)個(gè)大小不一的圓形空泡（圖1）。

圖1 NLsDM患者外周血白細(xì)胞形態(tài)（瑞-姬氏染色，×1 000）Figure 1 Morphology of peripheral blood leukocytes in NLsDM patients（Wright-Giemsa staining）

當(dāng)人體存在細(xì)菌感染時(shí)，中性粒細(xì)胞胞質(zhì)中亦可見(jiàn)空泡變性（圖2）。為了更好地與感染相鑒別，本研究進(jìn)行了中性粒細(xì)胞堿性磷酸酶染色（NAP）、髓過(guò)氧化物酶染色（MPO）和糖原染色（PAs）。NAP（圖3）：根據(jù)中性粒細(xì)胞胞質(zhì)中有無(wú)陽(yáng)性顆粒及多少和分布情況分為（-）、（+）、（++）、（+++）和（++++），分別對(duì)應(yīng)0～4分，100個(gè)細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù)為陽(yáng)性率，陽(yáng)性細(xì)胞積分之和為積分值[4]。NLsDM患者的中性粒細(xì)胞胞質(zhì)中呈陰性反應(yīng)，與正常人和感染患者差異明顯，感染患者陽(yáng)性率和積分值均明顯增高；MPO（圖4）：NLsDM患者的中性粒細(xì)胞胞質(zhì)中呈陽(yáng)性反應(yīng)，與正常人的中性粒細(xì)胞陽(yáng)性程度接近，但弱于感染患者（陽(yáng)性顆粒粗大覆蓋在細(xì)胞核上，導(dǎo)致細(xì)胞核結(jié)構(gòu)不清）；PAs（圖5）：NLsDM患者、正常人及感染患者的中性粒細(xì)胞陽(yáng)性反應(yīng)程度均未見(jiàn)明顯差異。提示NAP可作為鑒別NLsDM與感染患者最佳的染色方法。

圖2 感染患者外周血白細(xì)胞形態(tài)（瑞-姬氏染色，×1 000）Figure 2 Morphology of peripheral blood leukocytes in infected patients（Wright-Giemsa staining）

圖3 NLsDM患者、正常人和感染患者的中性粒細(xì)胞（NAP，×1 000）（從左到右）Figure 3 Neutrophil of NLsDM patients，healthy individualsand infected patients（NAP staining）（from left to right）

圖4 NLsDM患者、正常人和感染患者的中性粒細(xì)胞（MPO，×1 000）（從左到右）Figure 4 Neutrophil of NLsDM patients，healthy individuals and infected patients（MPO staining）（from left to right）

圖5 NLsDM患者、正常人和感染患者的中性粒細(xì)胞（PAs，×1 000）（從左到右）Figure 5 Neutrophil of NLsDM patients，healthy individuals and infected patients（PAs staining）（from left to right）

3 討論

1953年JORDANs[5]在臨床表現(xiàn)為肌營(yíng)養(yǎng)不良的兄弟二人中首次發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞胞內(nèi)脂肪滴。1966年，ROZENsZAJN等[6]在一對(duì)患者嚴(yán)重先天性魚(yú)鱗病的姐妹外周血白細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象，并將之命名為Jordan's小體。1985年該疾病被命名為Chanarin-Dorfman綜合征，又稱NLsDI。2001年，LEFèVRE等[7]確認(rèn)該病致病基因?yàn)镃GI-58。NLsDM的發(fā)現(xiàn)相對(duì)較晚。1994年，WEssALOWsKI等[8]首次描述了1例表現(xiàn)為肌無(wú)力、肝腫大和高CK的4歲男性患兒，其肌細(xì)胞及外周血粒細(xì)胞內(nèi)均可見(jiàn)脂肪滴沉積，患兒9歲的姐姐同樣存在高CK及粒細(xì)胞脂肪滴沉積，2人均無(wú)先天性魚(yú)鱗病癥狀，當(dāng)時(shí)認(rèn)為是臨床表型較輕的變異型NLsDI。2007年，F(xiàn)IsCHER等[9]報(bào)道了首例經(jīng)基因檢測(cè)證實(shí)的NLsDM病例；陳涓涓等[10]于2009年報(bào)道了我國(guó)首例NLsDM病例。截至2020年，國(guó)內(nèi)外累計(jì)報(bào)道經(jīng)基因檢測(cè)證實(shí)的NLsDM病例70余例，但是國(guó)內(nèi)尚未發(fā)現(xiàn)NLsDI病例[1]。

NLsDM患者男女比例無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，任何年齡均可發(fā)病，但多起始于成年人，進(jìn)展緩慢，主要臨床表現(xiàn)為單純肌病、骨骼肌+心肌病及心肌血管病[11]，如肌無(wú)力、肌肉疼痛、活動(dòng)后易疲勞及無(wú)癥狀性高CK血癥[12]。無(wú)癥狀高CK血癥患者年齡一般偏小，表明在短期內(nèi)肌纖維中脂肪的蓄積并不影響肌肉的收縮功能[13]。30歲左右出現(xiàn)緩慢進(jìn)展的肌無(wú)力癥狀，不對(duì)稱性肢體無(wú)力為其特點(diǎn)之一，且以右側(cè)肢體受累明顯。受累肌肉以承重?。ㄈ缂珉螏Ъ?、椎旁肌、大腿后部肌肉）較為突出，上肢重于下肢，近端重于遠(yuǎn)端。除單純骨骼肌受累外，其他器官也可受累，一般無(wú)皮膚損害。心臟損害在NLsDM患者中較多見(jiàn)，一般晚于肌無(wú)力出現(xiàn)，表現(xiàn)為心悸、氣喘、易疲勞以及水腫、咳嗽、夜尿增多等心功能不全癥狀，也可出現(xiàn)心絞痛癥狀[14]。ZHANG等[15]進(jìn)行的一項(xiàng)針對(duì)國(guó)內(nèi)45例NLsDM患者的研究發(fā)現(xiàn)，患者表現(xiàn)為無(wú)癥狀CK增高2例、單純骨骼肌病18例、單純心肌病4例、骨骼肌和心肌同時(shí)受累21例；除此之外，患者可合并糖尿病、高脂血癥、胰腺炎、感音神經(jīng)性耳聾等。MAssA等[16]進(jìn)行的一項(xiàng)包含34例NLsDM患者的研究表明，患者除了存在骨骼肌受累外，還存在心肌損害（32%）、肝臟損害（23%）、糖尿?。?3%）、身材矮?。?8%）、胰腺炎（15%）、神經(jīng)性耳聾（9%）、甲狀腺功能減退（6%）以及認(rèn)知障礙（3%）。

NLsDM患者中性粒細(xì)胞的形態(tài)異常與感染時(shí)的空泡變性較為相似，但是二者又存在明顯不同，主要表現(xiàn)為以下幾點(diǎn)：（1）中毒性改變的空泡變性只見(jiàn)于中性粒細(xì)胞，而NLsDM患者的中性粒細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞、嗜堿粒細(xì)胞及單核細(xì)胞胞質(zhì)中均可見(jiàn)空泡；（2）中毒性改變除可見(jiàn)空泡變性外，一般還伴有中性粒細(xì)胞的中毒顆粒、杜勒小體等其他形態(tài)學(xué)異常；（3）中毒性改變的空泡變性僅見(jiàn)于部分中性粒細(xì)胞，而NLsDM患者的絕大部分中性粒細(xì)胞胞質(zhì)中均可見(jiàn)空泡，且空泡的形狀較圓、數(shù)量較多（1個(gè)細(xì)胞中可達(dá)10個(gè)以上）。通過(guò)以上形態(tài)學(xué)的差異，基本可區(qū)分NLsDM與感染時(shí)的空泡變性。但是，由于正常人外周血中的單核細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞及嗜堿粒細(xì)胞的比例較低，特別在感染時(shí)會(huì)進(jìn)一步降低，而且部分感染患者只有空泡變性，不伴有中毒顆粒等其他形態(tài)學(xué)異常，導(dǎo)致通過(guò)以上要點(diǎn)進(jìn)行鑒別會(huì)比較困難。如果患者形態(tài)學(xué)特點(diǎn)不夠典型，可加做NAP染色。NLsDM患者中性粒細(xì)胞胞質(zhì)中存在脂肪沉積，可能會(huì)影響其胞質(zhì)中酶活性，因此NAP呈陰性反應(yīng)；而感染患者胞質(zhì)中酶活性明顯增強(qiáng)，陽(yáng)性率和積分值均明顯增高。相比MPO和PAs，NAP能夠更好地將二者進(jìn)行區(qū)分。

文獻(xiàn)報(bào)道NLsDM患者外周血和骨骼肌油紅O染色可見(jiàn)脂肪滴沉積，是篩查NLsDM的重要輔助手段[11]。但是，也有個(gè)別無(wú)脂肪沉積的病例[17-18]。而且，油紅O染色操作繁瑣、費(fèi)時(shí)長(zhǎng)，外周血中性粒細(xì)胞更不容易著色，經(jīng)常出現(xiàn)假陰性。相比而言，外周血瑞-姬氏染色和NAP操作簡(jiǎn)單，在臨床實(shí)驗(yàn)室均可常規(guī)開(kāi)展，更容易發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞的形態(tài)異常。因此，對(duì)于臨床中發(fā)現(xiàn)的高CK血癥、隱匿起病的骨骼肌無(wú)力或有心肌損傷癥狀的患者，如果外周血白細(xì)胞出現(xiàn)上述典型的形態(tài)學(xué)特征，應(yīng)考慮NLsDM的可能性，建議盡快完善PNPLA2基因檢測(cè)以明確診斷。

作者貢獻(xiàn)：邢瑩設(shè)計(jì)研究方案、負(fù)責(zé)論文起草；普程偉、尚柯負(fù)責(zé)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)及圖片采集；屈晨雪負(fù)責(zé)最終版本修訂，對(duì)論文負(fù)責(zé)。

本文無(wú)利益沖突。