樓曉慧，南麗紅，彭衛(wèi)華，陳亞萍，官夢(mèng)倩

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122；2.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇〇醫(yī)院，福建 福州 350025；3.福建省免疫性慢性腎病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，福建 福州 350025；4.東部戰(zhàn)區(qū)腎臟病醫(yī)學(xué)中心，福建 福州 350025）

腎間質(zhì)纖維化（renal interstitial fibrosis，RIF）被認(rèn)為是各種慢性腎臟病發(fā)生、發(fā)展直至終末期腎衰竭的主要病理基礎(chǔ)之一［1］，因此加強(qiáng)對(duì)RIF 的發(fā)病機(jī)制和防治研究尤為必要。目前研究認(rèn)為RIF 病理過程是在炎癥、缺血、缺氧等因素作用下，成纖維細(xì)胞活化增殖，轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞并分泌Ⅰ型膠原，最終導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)（extra cellular matrix，ECM）在間質(zhì)內(nèi)過度沉積，使腎功能減退直至腎衰竭［2］。有研究發(fā)現(xiàn)：在RIF 發(fā)生過程中，腎間質(zhì)中新增成纖維細(xì)胞大多來源于腎小管上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn) 分化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）［3］，因此，EMT 在RIF 發(fā)生過程中起關(guān)鍵作用。

筋骨草為福建常用中草藥，又名苦草、金瘡小草、白毛夏枯草等，為唇形科植物金瘡小草（Ajuga decumbensThunb.）的全草，其有效成分為黃酮類化合物［4］。前期研究發(fā)現(xiàn)筋骨草總黃酮（total flavo?noids of Ajuga，TFA）可降低轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGFβ1）的表達(dá)，減少膠原沉積，具有改善小鼠肺間質(zhì)纖維化的作用［5］，并有抑制腎小球腎炎系膜增生、改善腎功能的作用［6］。但TFA 是否具有抑制RIF 的作用，目前未見相關(guān)報(bào)道。故本研究擬采用單側(cè)輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）模型，探討TFA 對(duì)RIF 是否具有干預(yù)作用及其可能的作用機(jī)制，為其進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材 料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)SD 雄性大鼠40 只，體質(zhì)量為（180±20）g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（浙）2019-0002，于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF 級(jí)飼養(yǎng)室飼養(yǎng)1 周，許可證號(hào)：SYXK（閩）2019-0007。

1.2 藥物與試劑 TFA 粉末（寶雞市辰光生物科技有限公司，批號(hào)：HG211206）；肌酐（Scr）測(cè)定試劑盒（貨號(hào)：C011-2-1）、尿素氮（BUN）試劑盒（貨號(hào)：C013-2-1）均購自南京建成生物工程研究所；SDSPAGE 配膠試劑盒（貨號(hào)：P0012A）、RIPA 裂解液（貨號(hào)：P0013）均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；特超敏化學(xué)發(fā)光液（大連美侖生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：ma0186）；β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）一抗（貨號(hào)：CPA9100）、上皮鈣黏素（E-cadherin）一抗（貨號(hào)：CPA1199）、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）一抗（貨號(hào)：CPA9212）均購自英國Cohesion Biosciences 公司；HRP 標(biāo)記山羊抗鼠二抗（貨號(hào)：7076P2）、HRP 標(biāo)記山羊抗兔二抗（貨號(hào)：7074s）均購自美國Cell Signal Technology 公司；PVDF 膜（美國Millipore 公司，貨號(hào)：ISEQ00010）。

1.3 主要儀器 Infinite 200PRO 多功能酶標(biāo)儀（瑞士TECAN 公司）；DMi8 倒置熒光顯微鏡（德國Leica公司）；ChemiDoc XRS＋化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國Bio Rad 公司）；HM 325 石蠟切片機(jī)（美國Thermo Fisher 公司）；Centrifuge 5418 高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf 公司）。

2 方 法

2.1 UUO 大鼠模型的制備 將40 只雄性SD 大鼠，按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組8 只和造模組32 只。造模組大鼠采用左側(cè)輸尿管結(jié)扎制備UUO 模型［7］，具體步驟：腹腔注射3%戊巴比妥鈉（1 mL/kg體質(zhì)量）麻醉；將大鼠固定于操作臺(tái)上，備皮，碘伏消毒，鋪洞巾，在左側(cè)肋腰點(diǎn)位置逐層切開皮膚、肌肉，暴露左側(cè)腎臟，分離出輸尿管；用4-0 絲線在左側(cè)輸尿管近腎盂處和輸尿管上1/3 處結(jié)扎，在兩道絲線結(jié)扎點(diǎn)間剪斷輸尿管以防逆行感染；檢查手術(shù)視野無持續(xù)出血后，將腎臟置于原位，逐層縫合皮下組織及皮膚，即制備成功UUO 模型［8］。假手術(shù)組大鼠僅開腹并分離左側(cè)輸尿管，但不結(jié)扎和剪斷輸尿管。2 組大鼠術(shù)后均予青霉素10 萬U 腹腔注射（1 mL/100 g 體質(zhì)量），連續(xù)3 d 抗感染。

2.2 分組及給藥 造模組造模成功后采用隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組，低、中、高劑量組，每組各8 只。術(shù)后第1 天開始給藥，各組均按1 mL/100 g 體質(zhì)量灌胃，假手術(shù)組和模型組灌服蒸餾水，低、中、高劑量組分別灌服54、108、216 mg/mL TFA 水溶液。各組均1 次/d，連續(xù)14 d。

2.3 樣本采集 末次給藥2 h 后，麻醉大鼠，打開腹腔，行腹主動(dòng)脈采血約3 mL，室溫條件下靜置1 h，3 000 r/min 離心15 min，分離血清。然后打開胸腔，暴露心臟，將心包打開，滴少許生理鹽水保持濕潤(rùn)，在左心室尖剪開一小孔，將連接裝有50 mL 4℃預(yù)冷的生理鹽水注射器的灌胃針從小孔插入左心室直至升主動(dòng)脈內(nèi)，用止血鉗固定針頭，使灌胃針不能退出心臟，然后進(jìn)行推注；待見到右心房逐漸膨脹起來時(shí)，用小剪刀將右心耳剪開一小孔，使血液排出，如此沖洗直至雙腎變?yōu)樯n白色；去除左側(cè)腎臟表面被膜及脂肪組織，快速剝離左側(cè)腎臟組織，將左側(cè)腎臟組織自腎門處作冠狀切面對(duì)半剖開，取腎臟組織的1/4 置于4%多聚甲醛固定24 h，常規(guī)脫水、石蠟包埋后備用，后期用于HE 染色和Masson染色；剩余腎臟組織放入液氮后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 觀察指標(biāo)

2.4.1 Scr、BUN 含量檢測(cè) 嚴(yán)格按照肌酐測(cè)定試劑盒說明書及尿素氮試劑盒說明書，分別采用肌氨酸氧化酶法、脲酶法測(cè)定大鼠血清Scr、BUN 含量。

2.4.2 左側(cè)腎臟組織病理形態(tài)學(xué)和纖維化程度觀察 采用“2.3”項(xiàng)中的組織包埋塊，切片，常規(guī)脫蠟復(fù)水后，分別進(jìn)行HE 染色和Masson 染色。HE 染色：蘇木素浸染，1%鹽酸酒精分藍(lán)，自來水浸泡反藍(lán)，伊紅浸染，浸洗，樹脂封片，在倒置熒光顯微鏡400 倍鏡下觀察左側(cè)腎臟組織病理改變并攝片。Masson 染色：蘇木素核染5 min，分化液涮洗30 s，1%醋酸分化后水洗反藍(lán)，麗春紅品紅染液反應(yīng)8 min，蒸餾水沖洗后用1%磷鉬酸溶液處理5 min，1%醋酸涮洗，而后0.1%固綠復(fù)染15 min，水洗、封片，于倒置熒光顯微鏡400 倍鏡下觀察左側(cè)腎臟組織膠原纖維分布情況并攝片。每張切片隨機(jī)選取5 個(gè)部位進(jìn)行圖像采集，通過Image J 24.0 軟件分析計(jì)算每張切片腎臟組織綠色染色陽性面積（呈綠色染色為膠原纖維陽性表達(dá)［9］）占整個(gè)視野百分比，得出膠原容積分?jǐn)?shù)（CVF），以此判定大鼠腎臟組織纖維化面積。

2.4.3 Western blot檢測(cè)左側(cè)腎臟組織中E-cadherin、α-SMA 蛋白相對(duì)表達(dá)量 每組隨機(jī)選取3 只大鼠，取左側(cè)腎臟組織約100 mg，加入RIPA 裂解液提取組織中總蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白濃度，加入上樣緩沖液制成蛋白樣品，沸水浴15 min 使蛋白變性，制備SDS-PAGE 凝膠，進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉；于4℃條件下孵育一抗（β-actin稀釋比為1∶5 000，E-cadherin稀釋比為1∶1 500，α-SMA 稀釋比為1∶10 000）過夜，TBST 洗膜后室溫孵育二抗（HRP 標(biāo)記山羊抗鼠二抗、HRP 標(biāo)記山羊抗兔二抗稀釋比均為1∶3 000）70 min，以特超敏ECL 顯影液進(jìn)行顯影，于ChemiDoc XRS＋化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)上成像并拍照。采用Im?age J v1.80 軟件測(cè)定條帶灰度值，以目標(biāo)蛋白條帶與內(nèi)參蛋白條帶的灰度值比值表示上述蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料屬正態(tài)分布以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊者采用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊者采用Games-Howell 檢測(cè)。

3 結(jié) 果

3.1 各組血清Scr、BUN 含量比較 見表1。

表1 各組血清Scr、BUN 含量比較（±s）

表1 各組血清Scr、BUN 含量比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.01，3）P＜0.05。

組別假手術(shù)組模型組低劑量組中劑量組高劑量組n8 8 8 8 8 Scr/（μmol/L）32.68±6.67 48.41±5.981）45.10±9.47 27.68±2.262）30.16±8.442）BUN/（nmol/L）6.18±0.44 12.62±2.171）11.31±1.79 9.10±2.233）10.79±3.38

3.2 各組大鼠左側(cè)腎臟組織病理形態(tài)變化比較 見圖1。HE 染色結(jié)果顯示：假手術(shù)組大鼠腎小管結(jié)構(gòu)排列整齊，腎小球形態(tài)規(guī)則，間質(zhì)正常，未見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組可見腎小管腫大，管腔間隙狹窄，腎小球萎縮，上皮細(xì)胞變性、腫大，纖維組織增生明顯，可見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；與模型組比較，各藥物組腎小管腔擴(kuò)張，腎小球萎縮、上皮細(xì)胞變性、纖維組織增生、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等情況均有所減輕。以上結(jié)果顯示TFA 能明顯改善左側(cè)腎臟組織病理損傷。

圖1 各組大鼠左側(cè)腎臟組織病理形態(tài)變化（HE 染色，×400）

3.3 各組大鼠左側(cè)腎臟組織纖維化程度比較 見圖2 和表2。Masson 染色結(jié)果顯示：假手術(shù)組只在腎小管毛細(xì)血管周圍、系膜區(qū)及腎小球基底膜可見少量膠原；模型組大鼠腎臟間質(zhì)病變嚴(yán)重，腎小管結(jié)構(gòu)明顯破損，有大量膠原形成，間質(zhì)增寬，纖維化成灶狀分布，腎間質(zhì)纖維化程度明顯加重；各藥物組均可觀察到腎間質(zhì)管腔不同程度增寬、膠原纖維不同程度增生的情況，但較模型組均有所減輕。

圖2 各組大鼠左側(cè)腎臟組織膠原纖維分布情況（Masson 染色，×400）

表2 各組大鼠左側(cè)腎臟組織CVF 比較（±s）

表2 各組大鼠左側(cè)腎臟組織CVF 比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.05，3）P＜0.01。

組別假手術(shù)組模型組低劑量組中劑量組高劑量組n8 8 8 8 8 CVF/%8.13±4.63 55.76±5.31）43.26±3.532）38.69±3.733）42.52±5.443）

3.4 各組大鼠左側(cè)腎臟組織E-cadherin、α-SMA 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 見表3 和圖3。

表3 各組大鼠左側(cè)腎臟組織E-cadherin、α-SMA 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表3 各組大鼠左側(cè)腎臟組織E-cadherin、α-SMA 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，1）P＜0.01，2）P＜0.05；與模型組比較，3）P＜0.05。

組別假手術(shù)組模型組低劑量組中劑量組高劑量組n3 3 3 3 3 E-cadherin 1.00±0.00 0.18±0.041）0.20±0.04 0.38±0.913）0.24±0.07 α-SMA 1.00±0.00 2.42±0.702）1.86±0.57 1.27±0.113）1.33±0.17

圖3 各組大鼠左側(cè)腎臟組織E-cadherin、α-SMA 蛋白條帶圖

4 討 論

RIF 是各種慢性腎病發(fā)展至終末期腎衰竭的共同途徑和主要病理基礎(chǔ)，EMT 被認(rèn)為是目前RIF進(jìn)展中導(dǎo)致ECM 過度沉積的主要病理機(jī)制。在EMT 過程中，α-SMA 陽性腎小管上皮細(xì)胞移行到腎間質(zhì)中，活化并增殖成為肌成纖維細(xì)胞，其合成并分泌大量膠原，使ECM 過量分泌并積聚排列紊亂，進(jìn)而導(dǎo)致RIF。EMT 后的細(xì)胞由鵝卵石型變成梭形，類似成纖維細(xì)胞形態(tài)，不再表達(dá)上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin，腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)α-SMA 提示其出現(xiàn)轉(zhuǎn)分化現(xiàn)象［10-11］。因此，α-SMA、E-cadherin是EMT 發(fā)生及RIF 的標(biāo)志性蛋白。

目前研究RIF 的模型較多，但UUO 模型通過結(jié)扎單側(cè)輸尿管引起腎血流動(dòng)力學(xué)和代謝的明顯改變，可在短期內(nèi)造成RIF 的病理特點(diǎn)，十分接近于人類RIF 自發(fā)的病理過程。大鼠在單側(cè)輸尿管梗阻術(shù)后，RIF 成模率可達(dá)100%［12］，使得UUO 模型成為目前應(yīng)用最廣泛的RIF 動(dòng)物模型［13］。PICARD等研究發(fā)現(xiàn)：UUO 術(shù)后第1 天，腎間質(zhì)中便可見α-SMA 陽性表達(dá)，表明腎間質(zhì)中成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化在UUO 術(shù)后早期即可啟動(dòng)，隨著病變時(shí)間持續(xù)，腎間質(zhì)中α-SMA 的表達(dá)呈進(jìn)行性增加［14］。課題組前期通過半定量分析大鼠梗阻側(cè)腎臟組織CVF 和α-SMA 蛋白相對(duì)表達(dá)量以評(píng)價(jià)UUO 模型制備的成模情況，結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致［12，14］。故本實(shí)驗(yàn)采用結(jié)扎左側(cè)輸尿管的方法建立UUO 大鼠模型，并于術(shù)后第1 天開始給藥。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：UUO 術(shù)后大鼠血清Scr、BUN含量明顯升高，左側(cè)腎臟組織中CVF 和間充質(zhì)標(biāo)志物α-SMA 蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯增高，上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin 蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯減少，梗阻側(cè)腎臟組織出現(xiàn)RIF 典型的病理改變，提示模型制備成功，且在UUO 模型中EMT 過程已發(fā)生。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為RIF 主要的發(fā)病機(jī)制在于濕熱濁毒內(nèi)蘊(yùn)，瘀血內(nèi)阻，致腎失封藏［15］。濕熱之邪不僅可以損傷腎臟，更可阻滯經(jīng)絡(luò)，影響血液在經(jīng)脈中的運(yùn)行，進(jìn)一步加重瘀血病理改變［16］。血液流變學(xué)研究也證明濕邪較重的患者，其血液黏稠度較高［17］。而血流的緩慢和瘀滯會(huì)影響腎臟微循環(huán)中血液的正常灌流，引起微循環(huán)障礙，加重細(xì)胞損傷，致使ECM 沉積，纖維化加重［18］。由此可見：濕熱與瘀血在RIF 發(fā)病過程中起著非常重要的作用，二者相互影響，成為腎功能持續(xù)惡化的重要因素。有研究表明活血化瘀、清熱祛濕中藥可改善微循環(huán)，降低血液黏稠度，從而抑制成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化，減少ECM 生成［19］。

筋骨草性寒味苦，具有清熱解毒、散瘀消腫的功效［20］，且苦能燥濕，故有助于改善RIF 狀況。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：筋骨草的有效成分TFA 干預(yù)后可明顯降低UUO 模型大鼠血清Scr、BUN 含量，改善患側(cè)腎臟組織病理損傷，并可明顯減少患側(cè)腎臟組織中ECM 積聚，減輕腎間質(zhì)纖維化程度，提示TFA 具有保護(hù)腎功能的作用；中劑量TFA 還可明顯抑制UUO 模型大鼠腎臟組織中α-SMA 蛋白表達(dá)，減少E-cadherin 蛋白丟失，提示TFA 可通過抑制EMT 進(jìn)展，延緩RIF 形成，從而發(fā)揮保護(hù)腎功能的作用。