訾 勇，張楚天，羅 燕，李茜羽，姚淑紅，陳小倩，蔡 晶*

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三人民醫(yī)院，福建 福州 350108；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122）

當(dāng)今中國(guó)已經(jīng)步入了老齡化階段，是全球老年人口最多的國(guó)家［1］。隨著老齡化趨勢(shì)不斷加快，給我國(guó)社會(huì)和經(jīng)濟(jì)發(fā)展帶來(lái)了巨大挑戰(zhàn)［2-3］。衰老主要表現(xiàn)為骨骼肌肉量、肌肉力量和（或）功能逐漸喪失，即與年齡有關(guān)的肌少癥，是目前衰老機(jī)制研究熱點(diǎn)［4］。沉默信息調(diào)節(jié)因子2 相關(guān)酶（SIRT）是機(jī)體內(nèi)重要的能量代謝感受器［5］，與細(xì)胞衰老等密切相關(guān)。SIRT1 是SIRT 家族重要成員之一，叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O3（FoxO3）是SIRT1 底物之一，二者在抑制衰老和骨骼肌萎縮機(jī)制中具有重要作用。腎虛血瘀是老年疾病的重要發(fā)病機(jī)制［6］，蔡晶教授臨床經(jīng)驗(yàn)方補(bǔ)腎活血顆粒在老年衰弱的治療方面取得較好療效，故本研究探討補(bǔ)腎活血顆粒對(duì)衰老大鼠骨骼肌細(xì)胞保護(hù)作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥物 補(bǔ)腎活血顆粒由肉蓯蓉、制黃精、丹參、淫羊藿組成，由福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三人民醫(yī)院中藥房提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)選用8 周齡SD 大鼠（SPF 級(jí)）10 只，雌雄各半，雄性體質(zhì)量（275±10）g，雌性體質(zhì)量（202±3）g；雄性12 月齡SD 大鼠（SPF 級(jí)）10 只，體質(zhì)量（845±125）g，雌性大鼠10 只，體質(zhì)量（425±65）g。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，許可證號(hào)：SCXK（滬）2019-0002，飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SKYX（閩）：2019-0007。本研究的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照動(dòng)物試驗(yàn)相關(guān)規(guī)定進(jìn)行，并經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三人民醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.3 主要試劑與儀器 病理切片機(jī)（德國(guó)Leica 公司，型號(hào)：RM2016）；正置光學(xué)顯微鏡（日本Nikon 公司，型號(hào)：Nikon Eclipse E100）；蘇木素染液套裝（武漢谷歌生物科技有限公司，型號(hào)：G1005）；酶標(biāo)儀（雷杜生物科技有限公司，型號(hào)：Rayto RT-6100）；圖像分析軟件（Adobe 圖像軟件設(shè)計(jì)公司，型號(hào)：Adobe PhotoShop）；ECL 顯影成像試劑盒、GAPDH抗體、HRP 標(biāo)記山羊抗兔（武賽維爾生物有限科技公司，批號(hào)：G2014、GB12002、GB23301）；SIRT1 抗體（美國(guó)Affinity 公司，批號(hào)：DF6033）；FoxO3 抗體（美國(guó)Immunoway 公司，批號(hào)：YT1763）；大鼠去乙?；福⊿IRT1）ELISA 試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，貨號(hào)：ml058817，批號(hào)：11/2020）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組及給藥 將20 只12 月齡SD 大鼠隨機(jī)分為自然衰老組及補(bǔ)腎活血顆粒組各10 例，以10 只3 月齡大鼠作為青年對(duì)照組。自然衰老組大鼠進(jìn)行自然衰老模型復(fù)制，參照文獻(xiàn)［7-8］，主要表現(xiàn)為抗應(yīng)激能力、免疫功能以及學(xué)習(xí)記憶功能的減退等符合人類衰老指征時(shí)，說(shuō)明造模成功。根據(jù)人-鼠體表面積比換算公式，計(jì)算出大鼠每日補(bǔ)腎活血顆粒服量為3.71 g/kg，將補(bǔ)腎活血顆粒用100 ℃純凈水配置成371 mg/mL含藥溶液，以10 mL/（kg·d）灌胃，每周連續(xù)6 d，停藥1 d，持續(xù)6 個(gè)月。青年對(duì)照組及自然衰老組未予任何干預(yù)。

2.2 大鼠腓腸肌組織形態(tài)學(xué)觀察 末次給藥后大鼠腹腔注射20%烏拉坦5～7 mL/kg 麻醉后，處死，快速取出腓腸肌組織，部分標(biāo)本保存于-80 ℃冰箱以備檢測(cè)。剩余標(biāo)本石蠟切片脫蠟至水，按序?qū)⑶衅萌攵妆舰?0 min，二甲苯Ⅱ20 min，無(wú)水乙醇Ⅰ5 min，無(wú)水乙醇Ⅱ5 min，75%酒精5 min，自來(lái)水洗；再次蘇木素染色3～5 min，鹽酸水溶液分化，氨水水溶液返藍(lán)，水洗；繼以伊紅染色，切片按序酒精脫水，置入伊紅染液染色5 min。封片后在光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠腓腸肌組織形態(tài)學(xué)。

2.3 Western blot 檢測(cè)大鼠腓腸肌SIRT1、FoxO3 蛋白相對(duì)表達(dá)量 取冰箱中腓腸肌組織，采用BCA蛋白定量法測(cè)定蛋白濃度。SDS-PAGE 電泳，采用PVDF 轉(zhuǎn)膜，加入相應(yīng)一抗GAPDH（1∶1000）、FoxO3（1∶500）、SIRT1（1∶500）后孵育過(guò)夜；后置于相應(yīng)二抗中再次孵育，ECL 顯影成像，使用Alpha 軟件處理系統(tǒng)分析蛋白條帶的光密度值，內(nèi)參為GAPDH，相對(duì)蛋白表達(dá)量水平為目標(biāo)蛋白條帶灰度值/GAP?DH。

2.4 ELISA 法檢測(cè)大鼠腓腸肌SIRT1 去乙?；富钚?稱取大鼠腓腸肌組織按體質(zhì)量（mg）∶體積（μL）＝1∶9 的比例加入9 倍體積的生理鹽水，在冰水浴條件下，機(jī)械勻漿，制備成10%勻漿液，以2 500~3 000 r/min 離心10 min，按照SIRT1 去乙酰化酶活性試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，2 組比較方差齊采用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊采用Game's Howell 檢驗(yàn)。

3 結(jié) 果

3.1 3 組大鼠腓腸肌組織形態(tài)學(xué)比較 青年對(duì)照組大鼠肌纖維呈紅色，肌纖維外膜清晰，肌纖維間細(xì)胞外基質(zhì)較少，細(xì)胞核偏小但規(guī)則，多分布在肌纖維周圍，細(xì)胞外纖維成分及其他細(xì)胞成分含量較少；自然衰老組大鼠肌纖維變性數(shù)目明顯增多，細(xì)胞呈現(xiàn)淡染，肌纖維間質(zhì)中淡紅色膠原纖維成分顯著增加，肌纖維間結(jié)締組織成分明顯增多，血管管腔顯著變??；補(bǔ)腎活血顆粒組大鼠肌纖維外膜為皺縮狀態(tài)，部分肌細(xì)胞細(xì)胞核表現(xiàn)出腫脹，分布在細(xì)胞中央，細(xì)胞外纖維成分稍增加，而且見少量深染色、體積小炎性細(xì)胞。見圖1。

圖1 3 組大鼠腓腸肌組織形態(tài)學(xué)HE 染色圖（×400）

3.2 3 組大鼠腓腸肌SIRT1、FoxO3 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 見圖2。

圖2 3 組大鼠Western Blot 檢測(cè)腓腸肌SIRT1、FoxO3 蛋白表達(dá)

3.3 3 組大鼠腓腸肌SIRT1 去乙酰化酶活性水平比較 見表1。

表1 3 組大鼠腓腸肌SIRT1去乙?；富钚运奖容^（±s）

表1 3 組大鼠腓腸肌SIRT1去乙酰化酶活性水平比較（±s）

注：與青年對(duì)照組比較，1）P＜0.05；與自然衰老組比較，2）P＜0.05。

組別青年對(duì)照組自然衰老組補(bǔ)腎活血顆粒組n 10 10 10 SIRT1去乙?；富钚?（ng/mL）14.140±1.099 11.300±0.7591）16.067±0.3461）2）

4 討 論

當(dāng)前隨著我國(guó)人口老齡化的不斷加劇，肌少癥將是我國(guó)老年病學(xué)及神經(jīng)病學(xué)等學(xué)科面臨的重大健康問(wèn)題與挑戰(zhàn)［9-10］。近年來(lái)的研究表明：SIRT1 直接參與低級(jí)及高級(jí)哺乳動(dòng)物壽命與衰老的調(diào)節(jié)，而且發(fā)揮非常重要作用。衰老是機(jī)體內(nèi)各部分器官系統(tǒng)的功能逐漸衰退的自然現(xiàn)象，伴隨著細(xì)胞數(shù)目不斷地減少，細(xì)胞功能也在不斷地衰減。

本研究結(jié)果表明：補(bǔ)腎活血顆粒可以調(diào)節(jié)大鼠腓腸肌組織SIRT1、FoxO3 蛋白表達(dá)及SIRT1 去乙?；富钚浴IRT1 是SIRT 家族中抗衰老作用的重要成員之一，是重要的長(zhǎng)壽基因［11］，SIRT1 廣泛參與老年骨骼肌功能與質(zhì)量衰減的調(diào)節(jié)［12］，SIRT1 通過(guò)去乙?；图せ頕oxO 途徑從而保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激介導(dǎo)的損傷［13］。臨床與實(shí)驗(yàn)研究均表明SIRT1 可以發(fā)生去乙?；瘡亩患せ睿?］。SIRT1 能夠與FoxO 相互作用，通過(guò)去乙?；疐oxO3調(diào)節(jié)其活性，從而在神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激等病理生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用［14-15］，直接或間接地去乙酰化FoxO。目前觀點(diǎn)認(rèn)為SIRT1 對(duì)FoxO 有雙刃劍效應(yīng)：首先可以抑制FoxO 所介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，這些作用均可使細(xì)胞存活率上升，延緩衰老進(jìn)程從而延長(zhǎng)機(jī)體壽命；其次可促進(jìn)FoxO 介導(dǎo)的DNA 損傷修復(fù)及應(yīng)激抗性，導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯，允許細(xì)胞有足夠的時(shí)間來(lái)修復(fù)損傷的DNA 以及抵抗氧化應(yīng)激，從而增加存活機(jī)會(huì)。因此，SIRT1 通過(guò)抗凋亡、穩(wěn)定氧化還原狀態(tài)、增強(qiáng)損傷后修復(fù)等，抑制不良因素對(duì)細(xì)胞的損傷，促進(jìn)細(xì)胞的存活［16］。

目前有研究也證實(shí)：衰老證候除氣、血、陰、陽(yáng)等虛證外，常常兼挾氣滯、痰濕瘀血等證，其中腎虛和瘀血是人體衰老的主要病機(jī)［17］。腎藏精，精生髓，骨髓充盈，骨骼強(qiáng)壯，運(yùn)動(dòng)靈活。若腎氣衰憊，則骨弱無(wú)力，行動(dòng)緩慢。正如《難經(jīng)正義·十四難》曰：“五損損于骨，骨痿不能起于床”。人體的生長(zhǎng)、發(fā)育、壯盛以至衰老的過(guò)程，亦是氣血由弱到強(qiáng)、由盛到衰的過(guò)程。氣血虛可致血瘀，氣滯亦可致血瘀。補(bǔ)腎活血顆粒方中君藥為肉蓯蓉，臣藥為淫羊藿［18］，黃精、丹參佐之，功能補(bǔ)腎填髓、活血化瘀。本研究結(jié)果證實(shí)了補(bǔ)腎活血顆粒通過(guò)刺激SIRT1去乙酰化酶活性、FoxO3 相關(guān)蛋白表達(dá)從而發(fā)揮其對(duì)骨骼肌組織保護(hù)和修復(fù)作用，提示SIRT1 可能參與了自然衰老大鼠骨骼肌衰減的過(guò)程，這也為中醫(yī)藥抗衰老研究提供理論依據(jù)。