付 榮，林澤英

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院風(fēng)濕科，廣州 510260)

皮膚型紅斑狼瘡(cutaneous lupus erythematosus，CLE)是一種主要累及皮膚和黏膜組織的自身免疫性疾病。70%～80%系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)患者出現(xiàn)皮膚損傷，并常以CLE作為其首發(fā)癥狀[1]。多達(dá)23%的CLE患者會(huì)發(fā)展為SLE，并且病情在數(shù)年時(shí)間內(nèi)有明顯進(jìn)展[2]。亞急性皮膚型紅斑狼瘡(subacute cutaneous lupus，SCLE)是CLE的一種亞型，其特征表現(xiàn)為排列成銀屑病狀(丘疹鱗狀)或環(huán)狀形態(tài)的鱗狀紅斑丘疹。約50%的SCLE患者符合SLE的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]。這些患者中嚴(yán)重中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腎臟疾病和嚴(yán)重全身性血管炎的發(fā)生率顯著高于無SCLE表現(xiàn)的SLE患者。目前針對(duì)SCLE的治療方案主要包括抗瘧藥、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑和使用防曬劑等，雖然這些治療方案在一定程度上改善了SCLE的進(jìn)展，但缺乏精準(zhǔn)性，長期使用可能帶來嚴(yán)重的不良反應(yīng)。

隨著生命科學(xué)及信息科學(xué)的進(jìn)展，生物信息學(xué)分析工具越來越廣泛地應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。采用先進(jìn)研究手段深入研究SCLE有助于探討SCLE的發(fā)病機(jī)制，尋找潛在治療靶點(diǎn)。本研究通過對(duì)美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)的基因表達(dá)匯編(Gene Expression Omnibus，GEO)數(shù)據(jù)庫中SCLE的基因芯片數(shù)據(jù)(GSE81071和GSE109248)進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘，結(jié)合微陣列技術(shù)和生物信息學(xué)分析，篩選出SCLE與正常對(duì)照組(NC)組間的差異表達(dá)基因(differential expressed genes，DEGs)。隨后進(jìn)一步對(duì)DEGs進(jìn)行功能富集、信號(hào)通路、Hub基因識(shí)別等分析，并利用CIBERSORT算法進(jìn)行22種免疫細(xì)胞的分析，確定了SCLE皮膚活檢標(biāo)本中的關(guān)鍵信號(hào)通路、基因及免疫細(xì)胞浸潤情況，為疾病認(rèn)識(shí)、藥物開發(fā)等提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)集

GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中檢索數(shù)據(jù)，選擇標(biāo)準(zhǔn)包括：(1)數(shù)據(jù)集包含正常皮膚活檢和SCLE皮膚活檢；(2)樣本種屬為Homo sapiens；(3)基因表達(dá)式矩陣。按照這些標(biāo)準(zhǔn)篩選出2個(gè)數(shù)據(jù)集(GSE81071和GSE109248)。從GEO網(wǎng)站下載基因表達(dá)矩陣和探針注釋文檔，然后根據(jù)提供的注釋文檔將特定探針轉(zhuǎn)換為相應(yīng)的基因名。GSE81071基于GLP19983平臺(tái)，包含正常皮膚組織7例，SCLE皮膚組織23例；GSE109248基于GLP10558平臺(tái)，包含正常皮膚組織14例，SCLE皮膚組織12例。

1.2 DEGs的篩選

利用RStudio1.3.1093軟件通過“Limma”包進(jìn)行基因表達(dá)矩陣的標(biāo)準(zhǔn)化和表達(dá)差異分析。篩選出|Log2FC|的差異閾值為1，調(diào)整后P<0.05的DEGs。利用“ggplot2”R包繪制火山圖。

1.3 基因本體論(GO)分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析

GO分析由3個(gè)方面組成，即生物學(xué)過程(biology process，BP)、分子功能(molecular funtion，MF)和細(xì)胞成分(cellular component，CC)，可幫助探討基因群的潛在聯(lián)系和相互作用[4]。KEGG是另一個(gè)生物信息數(shù)據(jù)庫，用作說明分子生物學(xué)意義和功能[5]。GO分析和KEGG通路富集分析利用“clusterProfiler”R包進(jìn)行[6]。選取調(diào)節(jié)后P<0.05的通路，利用“ggplot2”R包進(jìn)行可視化。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)搭建及關(guān)鍵分子篩選

利用網(wǎng)站基因分析工具STRING(http://string-db.org)和Metascape(https://metascape.org/gp/index.html)構(gòu)建DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)[7]。利用分子復(fù)合物檢測(molecular complex detection，MCODE)[8]篩選出PPI中最顯著模塊。導(dǎo)出PPI分析數(shù)據(jù)至Cytoscape(版本3.8.2)，按degree算法在Cytoscape的插件CytoHubba中計(jì)算出前10位節(jié)點(diǎn)作為樞紐基因[9]。

1.5 免疫細(xì)胞浸潤分析

數(shù)據(jù)集GSE81071基因表達(dá)矩陣進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后利用RStudio及CIBERSORT網(wǎng)站(http://cibersort.stanford.edu/)進(jìn)行22種免疫細(xì)胞浸潤分析[10]。篩選P<0.05的樣本，利用“pheatmap”R包繪制熱圖，“vioplot”R包繪制小提琴圖。

2 結(jié) 果

2.1 SCLE和NC皮膚活檢中的DEGs

對(duì)GSE81071和GSE109248數(shù)據(jù)集進(jìn)行去批次化處理及標(biāo)準(zhǔn)化后，GSE81071數(shù)據(jù)集篩選出130個(gè)DEGs，其中90個(gè)上調(diào)基因，40個(gè)下調(diào)基因，見圖1A；GSE109248數(shù)據(jù)集篩選出1 516個(gè)DEGs，其中879個(gè)上調(diào)基因，637個(gè)下調(diào)基因，見圖1B。GSE81071上調(diào) |Log2FC|前10位 基因?yàn)椋篕RT6C、CXCL10、CXCL9、PI3、ISG15、OAS1、KRT16、MX1、PARP14和GBP1；下調(diào)基因?yàn)镮GLV3-1、SCGB2A2、RPL21P28、SMR3A、PLEKHA8P1、RPRML、MT1H、IQCA1L、DAPL1和GMFB。GSE109248上調(diào) |Log2FC|前10位基因?yàn)锳POBEC3A、CXCL10、OASL、IFIT3、TYMP、ISG15、RSAD2、KLHDC7B、HERC6和IFI44L；下調(diào)基因?yàn)閁GT3A2、C9ORF127、MRAP、GSTM5、IL17D、ITGA10、MAOA、PPARGC1A、CLEC4GP1和ACP6。

A：GSE8107火山圖；B：GSE109248火山圖。

2.2 DEGs的GO分析和KEGG通路富集分析

兩個(gè)數(shù)據(jù)集的DEGs取交集，得到34個(gè)DEGs(圖2A)，進(jìn)行GO分析(包含BP、MF和CC)及KEGG富集分析。GO分析顯示，BP主要包括對(duì)病毒的防御反應(yīng)、對(duì)病毒的反應(yīng)、Ⅰ型干擾素信號(hào)通路、對(duì)Ⅰ型干擾素的細(xì)胞反應(yīng)和對(duì)Ⅰ型干擾素的反應(yīng)。在CC中，質(zhì)膜外側(cè)組分較有意義。MF主要包括雙鏈RNA結(jié)合過程、腺苷酸轉(zhuǎn)移酶活性、CXCR趨化因子受體結(jié)合、核苷酸轉(zhuǎn)移酶活性及趨化因子活性。KEGG通路富集分析顯示DEGs主要在丙型肝炎、甲型流感、麻疹、EB病毒感染和NOD樣受體(NOD like receptor，NLR)信號(hào)通路等富集，見圖2B。GO分析和KEGG通路富集分析結(jié)果的前5位，見表1。

A：GSE8107與 GSE109248韋恩圖；B：GO分析與KEGG富集分析。

表1 DEGs的GO分析和KEGG通路富集分析結(jié)果

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)和樞紐基因

使用STRING構(gòu)建DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)，除去不連貫的分子，有30個(gè)節(jié)點(diǎn)并形成171個(gè)連接邊。將DEGs導(dǎo)入Metascape網(wǎng)站并利用MCODE算法識(shí)別密集連接的網(wǎng)絡(luò)分子，按P值計(jì)算出前3個(gè)最有價(jià)值通路，見圖3、表2。利用Cytoscape中的CytoHubba選出10個(gè)Hub基因CXCL10、DDX58、RSAD2、OAS1、ISG15、OASL、OAS3、MX2、OAS2和GBP1，并繪制交匯網(wǎng)絡(luò)，見圖4。在所有DEGs中，CXCL10、DDX58和RSAD2是基于degree算法的核心基因。

圖3 Metascape網(wǎng)站構(gòu)建的DEGs網(wǎng)絡(luò)

2.4 免疫細(xì)胞浸潤分析

按照P<0.05過濾CIBERSORT分析結(jié)果后，GSE81071數(shù)據(jù)集的4例NC和34例SCLE被納入后續(xù)分析。22種免疫細(xì)胞表達(dá)情況繪制熱圖(圖5A)，樣本中CD8+T淋巴細(xì)胞、CD4+靜息記憶T淋巴細(xì)胞、CD4+活化記憶T淋巴細(xì)胞、活化的自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)、M1巨噬細(xì)胞和M2巨噬細(xì)胞表達(dá)水平較高。與NC組相比，SCLE組CD4+活化記憶T淋巴細(xì)胞比例明顯升高(P=0.007)，而Tregs細(xì)胞比例明顯降低(P=0.001)，見圖5B。

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)中的樞紐基因

A：NC與SCLE 22種免疫細(xì)胞熱圖；B：NC與SCLE 22種免疫細(xì)胞小提琴圖；B cells naive：初始B淋巴細(xì)胞；B cells memory：記憶B淋巴細(xì)胞；Plasma cells：漿細(xì)胞；T cells CD8：CD8+T淋巴細(xì)胞；T cells CD4 naive：初始CD4+T淋巴細(xì)胞；T cells CD4 memory resting：CD4+靜息記憶T淋巴細(xì)胞；T cells CD4 memory activated：CD4+活化記憶T淋巴細(xì)胞；T cells follicular helper：濾泡輔助性T淋巴細(xì)胞；T cells regulatory(Tregs)：調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞；T cells gamma delta：γ-δT淋巴細(xì)胞；NK cells resting：靜息自然殺傷細(xì)胞；NK cells activated：活化自然殺傷細(xì)胞；Monocytes：單核細(xì)胞；Macrophages M0：M0巨噬細(xì)胞；Macrophages M1：M1巨噬細(xì)胞；Macrophages M2：M2巨噬細(xì)胞；Dendritic cells resting：靜息樹突狀細(xì)胞；Dendritic cells activated：活化樹突狀細(xì)胞；Mast cells resting：靜息肥大細(xì)胞；Mast cells activated：活化肥大細(xì)胞；Eosinophils：嗜酸性粒細(xì)胞；Neutrophils：中性粒細(xì)胞。

表2 基于MCODE算法的GO通路

3 討 論

生物信息學(xué)分析是一種目前廣泛使用的對(duì)基因芯片或高通量測序的大數(shù)據(jù)進(jìn)行分析的方法。它可以通過比較不同樣本之間在基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、代謝組等方面的差異，篩選出顯著變化的DEGs，通過富集分析篩選出DEGs及富集通路，進(jìn)而通過數(shù)據(jù)平臺(tái)、網(wǎng)絡(luò)工具構(gòu)建分子互作網(wǎng)絡(luò)，篩選網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵調(diào)控分子。本研究通過對(duì)GSE81071和GSE109248數(shù)據(jù)集的交集進(jìn)行分析，共篩選出34個(gè)DEGs，通過GO分析和KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)：SCLE皮膚組織中Ⅰ型干擾素信號(hào)通路和對(duì)Ⅰ型干擾素的反應(yīng)通路明顯富集。對(duì)病毒的反應(yīng)和對(duì)病毒的防御反應(yīng)通路同樣明顯富集，其與Ⅰ型干擾素的釋放和功能也密切相關(guān)。這些證據(jù)提示Ⅰ型干擾素信號(hào)通路在SCLE發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。既往研究報(bào)道證實(shí)，SLE患者血清Ⅰ型干擾素明顯升高且與病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[11-12]。對(duì)SLE患者免疫細(xì)胞功能紊亂的研究發(fā)現(xiàn)，Ⅰ型干擾素信號(hào)通路通過促進(jìn)SLE患者B淋巴細(xì)胞增殖、存活及功能的發(fā)揮參與SLE進(jìn)展[13]。此外，Ⅰ型干擾素信號(hào)通路還可以抑制Treg細(xì)胞功能，從而增強(qiáng)紫外線照射導(dǎo)致的狼瘡模型小鼠T淋巴細(xì)胞的活化[14]。在SLE患者皮膚組織中，由凋亡細(xì)胞釋放的DNA和RNA顆?？烧T導(dǎo)漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生Ⅰ型干擾素[15-16]。這些研究證據(jù)表明，Ⅰ型干擾素信號(hào)通路通過調(diào)控及募集免疫細(xì)胞至病變組織中促進(jìn)SCLE發(fā)生、發(fā)展。

本研究進(jìn)一步通過CIBERSORT探討了SCLE病變組織中免疫細(xì)胞浸潤情況。結(jié)果顯示，與NC組相比，SCLE組CD4+活化記憶T淋巴細(xì)胞比例明顯升高，而調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(Treg)數(shù)目明顯降低。近年來Treg作為維持自身免疫耐受的主要免疫細(xì)胞類型受到廣泛關(guān)注。而一旦免疫反應(yīng)和耐受性的平衡被打破，則會(huì)發(fā)生包括紅斑狼瘡在內(nèi)的免疫紊亂[16-17]。研究表明，SCLE皮膚組織中Treg數(shù)目明顯減少，表明皮膚免疫耐受強(qiáng)度減弱，免疫反應(yīng)相應(yīng)增強(qiáng)，CD4+活化記憶T淋巴細(xì)胞比例明顯升高。有研究表明，在SCLE病變中，趨化因子CXCL9、CXCL10、CXCL11水平與表皮及真皮中CXCR3+CD3+T淋巴細(xì)胞分布呈正相關(guān)[18]。另一項(xiàng)研究表明，Ⅰ型干擾素誘導(dǎo)的CXCL10及IP10通過募集CXCR3+T淋巴細(xì)胞參與CLE皮膚病變的發(fā)生、發(fā)展[19]。以上證據(jù)提示，SCLE病變組織中免疫耐受被破壞，并且顯著升高的Ⅰ型干擾素可通過募集大量活化的T淋巴細(xì)胞參與SCLE皮膚病變進(jìn)展。

本研究還探討了DEGs與疾病譜之間的關(guān)系，從側(cè)面進(jìn)一步證明了Ⅰ型干擾素信號(hào)通路在SCLE病變發(fā)生、發(fā)展過程中的重要作用。但狼瘡患者α干擾素(IFN-α)水平較高目前原因尚不明確。外源性和內(nèi)源性誘導(dǎo)劑在SLE患者Ⅰ型干擾素誘導(dǎo)方面可能都發(fā)揮了重要作用，對(duì)于外源性誘導(dǎo)物，病毒和細(xì)菌病原體可能是罪魁禍?zhǔn)?，但研究人員目前仍未確定能夠?qū)е耂LE高Ⅰ型干擾素的特定病原體。盡管如此，IFN-α或β干擾素(IFN-β)的產(chǎn)生可能是多種病原體感染或其他外源性Ⅰ型干擾素刺激物誘導(dǎo)或加劇易感個(gè)體的全身性自身免疫的常見途徑，如感染或紫外線照射后SLE中常見的情況[18]。NLR信號(hào)通路是先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，其屬于細(xì)胞內(nèi)模式識(shí)別受體，可通過與細(xì)胞內(nèi)病原微生物產(chǎn)物識(shí)別后激活核因子-κB(NF-κB)通路，促發(fā)炎癥反應(yīng)及免疫反應(yīng)。其中Nod樣受體蛋白3(NLRP3)是NLR亞家族的重要成員。既往研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3炎癥小體在狼瘡腎炎組織中明顯活化，并參與狼瘡腎炎的進(jìn)展[19-20]，提示靶向NLRP3炎癥小體通路可能成為狼瘡治療的新靶點(diǎn)。

本研究通過基于degree算法的核心基因篩選出CXCL10、DDX58和RSAD2。CXCL10由Ⅰ型干擾素刺激的內(nèi)皮細(xì)胞分泌，其通過與CXCR3受體結(jié)合募集炎癥細(xì)胞促進(jìn)炎癥、感染和自身免疫性疾病發(fā)生、發(fā)展[20-22]。研究報(bào)道，在多種自身免疫性疾病中CXCL10水平明顯升高，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、SLE、系統(tǒng)性硬化癥和冷球蛋白血癥等[23]。在SLE患者中，CXCL10水平與SLE疾病活動(dòng)度指數(shù)(SLEDAI)和腎臟病變活動(dòng)情況呈正相關(guān)[24]。DDX58也稱為RIG-Ⅰ，屬于RIG-Ⅰ樣受體家族，是一種具有925個(gè)殘基的細(xì)胞質(zhì)病毒RNA受體[25]。DDX58在樹突細(xì)胞、上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞表達(dá)，并在病毒感染過程中表達(dá)增加，被認(rèn)為是與甲流病毒識(shí)別相關(guān)的RLR家族中最重要的成員[26]。RSAD2是干擾素誘導(dǎo)基因，參與針對(duì)病毒的先天性免疫反應(yīng)[27-28]，可激活免疫反應(yīng)并與多種自身免疫性疾病有關(guān)，如RA和SLE[28-29]。以上證據(jù)提示CXCL10、DDX58和RSAD2可能是潛在的預(yù)測和治療SCLE的生物標(biāo)志物。但是CXCL10、DDX58和RSAD2參與SCLE發(fā)病的機(jī)制目前尚不完全清楚，仍然需要深入、系統(tǒng)的基礎(chǔ)研究進(jìn)一步探明。

綜上所述，本研究分析了GSE81071和GSE109248數(shù)據(jù)集NC和SCLE皮膚活檢標(biāo)本的基因表達(dá)譜，篩選出34個(gè)DEGs，并進(jìn)行了GO分析和KEGG通路富集分析，發(fā)現(xiàn)SCLE中Ⅰ型干擾素通路顯著活化。利用CIBERSORT進(jìn)行免疫細(xì)胞浸潤分析，發(fā)現(xiàn)SCLE中CD4+活化記憶T淋巴細(xì)胞比例明顯升高，而Treg比例明顯下降。采用STRING構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，利用Cytoscape中的CytoHubba篩選出CXCL10、DDX58和RSAD2 3個(gè)核心基因。本研究為SCLE發(fā)病機(jī)制的探索提供了理論基礎(chǔ)，并為SCLE的早期診斷和靶向藥物研發(fā)提供了新的思路。