李江濤，邵文華，周文杰，余蓮英，楊謙

（江西省九江市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科，九江 332000）

食管癌是全球第八大常見癌癥， 也是第六大最常見的癌癥死亡原因[1-2]。 食管癌一旦發(fā)生，通常會(huì)迅速侵襲周圍組織和淋巴結(jié)[3]。 由于沒有早期癥狀、疾病的侵襲性和晚期診斷，其預(yù)后通常不佳[4]。 食管鱗狀細(xì)胞癌（Esophageal Squamous Cell Carcinoma,ESCC） 是世界范圍內(nèi)食管癌的主要組織學(xué)類型。ESCC 的病因尚不清楚， 流行病學(xué)研究表明吸煙、大量飲酒、 微量營(yíng)養(yǎng)素缺乏和飲食致癌物暴露可能導(dǎo)致惡性腫瘤[5]。 感染因子被認(rèn)為是直接致癌物或促進(jìn)因素，特別是人乳頭瘤病毒（HPV）已被假定為ESCC 的可能原因[6]。 目前研究證實(shí)了ESCC 中存在HPV。16 型和18 型HPV 是已知與頭頸，尤其口咽部腫瘤密切相關(guān)。 病毒致癌基因產(chǎn)物E6 和E7 在HPV 相關(guān)致癌作用中起關(guān)鍵作用[7]。 HPV 陽性腫瘤的特點(diǎn)是p16 的高表達(dá)， 其被認(rèn)為是鱗狀細(xì)胞癌背景下HPV 感染的替代標(biāo)志物。 一些回顧性臨床研究表明，HPV 陽性的頭頸部鱗狀細(xì)胞癌患者比HPV 陰性腫瘤預(yù)后更好[8]。 與口腔、扁桃體和咽部一樣，食道也可以感染這些病毒。 據(jù)推測(cè)，頭頸部鱗狀上皮和食道之間的組織學(xué)相似性暗示關(guān)聯(lián)和臨床特征。雖然既往有研究已經(jīng)在ESCC 患者中分析了HPV 狀態(tài)的預(yù)后價(jià)值，但結(jié)果存在很大爭(zhēng)議。 本研究旨在確定本地區(qū)ESCC 中HPV 感染的患病率并評(píng)估其臨床意義。 此外，本研究還試圖評(píng)估HPV 狀態(tài)對(duì)九江地區(qū)ESCC 患者生存率的影響。

1 材料與方法

1.1 納入患者和組織樣本 選取2011 年7 月至2016 年5 月間九江市第一人民醫(yī)院收治的原發(fā)性食管癌患者共131 例。男性82 例，女性27 例，患者中位年齡為61 歲（42～79 歲）。納入：經(jīng)過病理診斷為原發(fā)性食管癌且為鱗狀細(xì)胞亞型的患者；病理組織標(biāo)本齊全；術(shù)前未接受過放化療；圍術(shù)期未發(fā)生嚴(yán)重并發(fā)癥；病歷資料完整。 排除：手術(shù)后30 天內(nèi)死亡的患者；非鱗狀細(xì)胞亞型；無法回答問題或無法聯(lián)系的不合作患者。患者石蠟組織取自病理實(shí)驗(yàn)室。 其中，來自109 名患者的樣本具有足夠的ESCC腫瘤組織來檢測(cè)HPV 和p16 最終納入本研究中。所有組織行蘇木精和伊紅（H&E）染色，確保組織來源于食道癌組織。 剩余組織用于HPV 和p16 的檢測(cè)。所有組織學(xué)實(shí)驗(yàn)均由同一組病理醫(yī)生完成并出具報(bào)告。研究報(bào)九江市第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 隨訪調(diào)查 從所有患者術(shù)后隨訪數(shù)據(jù)中獲取以下參數(shù)：性別、年齡、腫瘤位置、術(shù)后病理T 和N狀態(tài)（pT 和pN）、 根據(jù)美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)TNM分期系統(tǒng)的TNM 分期、腫瘤的分化等級(jí)、輔助治療以及吸煙和飲酒的習(xí)慣。腫瘤的解剖定位分為食管上部（15～24 cm）、中部（25～34 cm）和食管下部（35～46 cm）。 腫瘤狀態(tài)分為局部（原發(fā)性腫瘤有或沒有局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移）或晚期疾?。ㄓ羞h(yuǎn)處轉(zhuǎn)移）。酒精攝入的界值是0.025 公斤/天， 臨界值制定參考2011 年中國(guó)居民膳食指南。 所有患者都有定期的隨訪計(jì)劃，包括完整的病史和體格檢查，在手術(shù)后的前2 年中每3 個(gè)月一次，之后每6 個(gè)月一次。必要時(shí)進(jìn)行常規(guī)放射學(xué)檢查和食管鏡檢查。 患者被隨訪至死亡或最多5 年。

1.3 HPV 檢測(cè) 使用生物素化探針的原位雜交法評(píng)估所有樣本的HPV-16 和HPV-18。 即：切片進(jìn)行常規(guī)脫蠟；進(jìn)行熱誘導(dǎo)靶標(biāo)修復(fù)；使用蛋白酶K消化； 然后應(yīng)用HPV-16 生物素化DNA 探針；將切片變性并用二氨基聯(lián)苯胺檢測(cè)系統(tǒng)染色； 切片用蘇木精復(fù)染；通過HPV-18 生物素化DNA 探針進(jìn)一步評(píng)估所有腫瘤的HPV-18。陽性對(duì)照是宮頸鱗狀細(xì)胞癌樣本。 所有組織均評(píng)分為陽性或陰性。局限于受感染腫瘤細(xì)胞核的棕色染色被定義為陽性， 所有評(píng)分均在不了解p16 免疫組織化學(xué)結(jié)果的情況下進(jìn)行。

1.4 p16 免疫組化 p16 免疫組化檢測(cè)： 福爾馬林固定；石蠟包埋的腫瘤標(biāo)本脫蠟；Tris-EDTA（PH=9.0） 熱誘導(dǎo)表位修復(fù)進(jìn)行抗原修復(fù)； 通過DakoEnvision-System 方法使用針對(duì)p16 的一抗孵育。 p16 陽性定義為＞50%的細(xì)胞顯示出強(qiáng)烈的核和細(xì)胞質(zhì)免疫標(biāo)記。 所有評(píng)分均在不了解臨床特征或結(jié)果的情況下進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 所有分析均使用SPSS 23.0 進(jìn)行。統(tǒng)計(jì)分析包括人口統(tǒng)計(jì)學(xué)和術(shù)后結(jié)果數(shù)據(jù)的單變量分析。 對(duì)于這些分析， 使用連續(xù)變量的Mann-Whitney 檢驗(yàn)和分類變量的卡方檢驗(yàn)或Fisher 精確檢驗(yàn)來檢驗(yàn)組間差異的顯著性。Kaplan-Meier 法和log-rank 檢驗(yàn)用于分析和比較生存曲線。 主要終點(diǎn)是總生存期（OS），定義為從手術(shù)日期到死亡的時(shí)間。 次要終點(diǎn)包括無進(jìn)展生存期（PFS），定義為從手術(shù)日期到死亡或首次記錄的復(fù)發(fā)的時(shí)間，被歸類為局部區(qū)域疾病 （原發(fā)部位或區(qū)域淋巴結(jié)的腫瘤）或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。 沒有記錄的復(fù)發(fā)部位的原發(fā)癌死亡或不明原因的死亡被認(rèn)為是局部區(qū)域疾病導(dǎo)致的死亡。 在單變量和多變量分析中，Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)模型用于確定變量對(duì)5 年OS 和PFS 的風(fēng)險(xiǎn)比（HR），結(jié)果以HR 及其95%置信區(qū)間（CI）的形式給出。 P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 納入患者特征比較 共有109 名患者（82 名男性和27 名女性）符合方案研究標(biāo)準(zhǔn)。 在手術(shù)日期時(shí)，患者的中位年齡為61（42～79）歲。 根據(jù)腫瘤HPV 狀態(tài)將患者分為兩組。HPV 陽性和HPV 陰性患者的基線特征見表1。兩組患者在性別、年齡、pT狀態(tài)、pN 狀態(tài)、TNM 分期、吸煙和飲酒等方面為差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 HPV 陽性和HPV 陰性患者的基線特征

2.2 HPV 和P16 分析 109 例ESCC 患者中有31例經(jīng)原位雜交確定為HPV 陽性， 所有陽性病例均為HPV-16，無HPV-18 DNA 呈陽性的患者。 HPV陽性組的中位年齡為61 歲（44～76 歲），HPV 陰性組為62 歲（42～78 歲）。 31 例HPV 陽性腫瘤中有26 例經(jīng)免疫組織化學(xué)染色呈p16 陽性。 p16 表達(dá)與HPV 陽性密切相關(guān)（P＜0.001），見表2。

表2 食管鱗癌中HPV 原位雜交與p16 免疫組化的相關(guān)性

2.3 生存分析 根據(jù)Kaplan-Meier 分析，HPV 陽性腫瘤患者的生存率高于HPV 陰性腫瘤患者（logrank P=0.003）。 HPV 陽性亞組的5 年OS 率為67.3%，HPV 陰性亞組為42.8%。 HPV 陽性患者的PFS也顯著優(yōu)于HPV 陰性患者（P=0.003）。 5 年P(guān)FS 率分別為62.4%和39.5%。 此外，腫瘤中HPV 和p16表達(dá)的存在具有良好的一致性 （r=0.60，P<0.0001）。 使用p16 表達(dá)作為分層因素， 我們發(fā)現(xiàn)OS 和PFS 的差異與基于HPV 狀態(tài)的差異一致，p16 表達(dá)陽性亞組的5 年OS 率為66.2%， 陰性亞組為47.9%（P=0.031）。5 年P(guān)FS 率分別為57.6%和39.2%（P=0.009）。 進(jìn)行單變量分析顯示腫瘤HPV狀態(tài)（HR=3.22，95%CI=1.56 至6.42）與PFS 相關(guān)。多變量分析顯示調(diào)整pT 狀態(tài)、pN 狀態(tài)、TNM 分期和吸煙后， 腫瘤HPV 狀態(tài)與死亡風(fēng)險(xiǎn)獨(dú)立相關(guān)，即：HPV 陽性腫瘤患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)比HPV 陰性患者低62.1%（調(diào)整后的OR=0.39，95%CI=0.15 到0.81，P=0.020）；腫瘤HPV 狀態(tài)也與PFS 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著相關(guān)性，HPV 陽性腫瘤患者的進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)比HPV 陰性腫瘤患者低61.3%（調(diào)整后的HR=0.35，95%CI=0.14 至0.73，P=0.006）。

3 討論

HPV 對(duì)鱗狀上皮具有嗜性， 可導(dǎo)致其過度增殖性病變。目前已確定130 多種HPV 類型，這些類型已根據(jù)其致癌潛力分為低風(fēng)險(xiǎn)或高風(fēng)險(xiǎn)型。 高危型HPV 與惡性腫瘤密切相關(guān)。根據(jù)之前的研究，HPV-16 是鱗狀細(xì)胞癌中最常見的類型， 其次是HPV-18， 而其他高危型HPV 類型很少。 HPV 在ESCC 中的病因?qū)W作用仍不清楚。 ESCC 中HPV 的發(fā)病率因地理區(qū)域而異。 據(jù)推測(cè)，ESCC 高發(fā)區(qū)的HPV 感染率高于ESCC 低發(fā)區(qū)[9]。 在本研究中，我們觀察到九江地區(qū)HPV 感染與ESCC 之間的關(guān)聯(lián)， 通過使用原位雜交在28.44%的病例中檢測(cè)到HPV，并且所有病例均為HPV-16 陽性。 該觀察結(jié)果與之前在中國(guó)其他ESCC 高危地區(qū)的研究一致[10]。 在本研究中，我們還發(fā)現(xiàn)HPV 陽性和陰性ESCC 腫瘤位置存在微小的差異（P=0.09），食管上段HPV 感染高于下段。這可能的原因是HPV 感染的途徑以及口咽鱗狀上皮和上消化道之間的組織學(xué)相似性。 HPV 目前是全世界最常見的性傳播感染之一。 許多研究已經(jīng)證實(shí)，性行為的變化可能能夠解釋HPV 陽性癌癥發(fā)病率的增加。 食道可以像口腔、扁桃體和咽部一樣感染這些病毒。

在本研究中，31 例HPV 陽性ESCC 病例中有26 例表達(dá)p16， 而78 例HPV 陰性亞組中有15 例表達(dá)p16。 我們觀察到通過原位雜交獲得的腫瘤HPV 狀態(tài)與通過免疫組織化學(xué)獲得的p16 之間有很強(qiáng)的一致性。 HPV 原位雜交檢測(cè)對(duì)單個(gè)病毒拷貝具有敏感性，陽性結(jié)果與HPV E6 和E7 癌基因的表達(dá)密切相關(guān)。 本研究的一個(gè)缺點(diǎn)是未檢測(cè)除HPV-16/18 之外的其他亞型。 p16 的表達(dá)對(duì)HPV類型沒有特異性。 因此，p16 免疫組化是ESCC HPV 感染的一個(gè)很好的替代指標(biāo)。

此外， 先前研究已經(jīng)在ESCC 患者中分析了HPV 狀態(tài)的預(yù)后價(jià)值。 然而， 結(jié)果引起了很大爭(zhēng)議。 Furihata 等[11]報(bào)道，在食管癌患者中HPV 陽性患者的生存率低于p53 過表達(dá)的HPV 陰性患者，因此認(rèn)為HPV 感染和p53 過表達(dá)表明預(yù)后不良。Hippelainen 等[12]報(bào)道，61 名ESCC 患者中有11%的患者HPV 陽性，但沒有預(yù)后價(jià)值。 Dreilich 等[13]發(fā)現(xiàn)與低病毒載量的患者相比， 高病毒載量的患者具有更高的存活率。 而我們的研究發(fā)現(xiàn)， 腫瘤HPV 狀態(tài)是ESCC 患者OS 和PFS 的獨(dú)立預(yù)后因素。 其他研究回顧性也一致地顯示，HPV 陽性腫瘤患者具有比陰性患者更好的預(yù)后。 在體外研究中，HPV-16 轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞的順鉑敏感性增加，這意味著更好的預(yù)后[14]。 免疫系統(tǒng)、HPV 狀態(tài)和預(yù)后之間的關(guān)系仍然是一個(gè)有趣的研究領(lǐng)域。 外周血中較高百分比的CD8 細(xì)胞和較低的CD4/CD8 比率以及較高的腫瘤微環(huán)境中CD4 和CD8 浸潤(rùn)的平均總和可能預(yù)示著更好的結(jié)果。 HPV 的整合導(dǎo)致癌蛋白E6/E7 的更高表達(dá)，從而削弱p53 和Rb 蛋白功能，促進(jìn)基因組重排。 理論上，重排的DNA 對(duì)放療和化療更敏感， 這為HPV 陽性腫瘤患者的生存率更高的跡象提供了部分解釋。

本研究盡管在HPV 陽性和陰性之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但由于該研究樣本量小且具有回顧性，因此得出的結(jié)論可能具有偏倚性。 需要更大規(guī)模的驗(yàn)證性研究來提供明確的證據(jù)。 此外，本研究無法確定HPV 感染和ESCC 發(fā)病的時(shí)間順序， 盡管觀察到感染與腫瘤之間的關(guān)聯(lián)， 但暴露與結(jié)果之間的因果關(guān)系并不清楚。 但本研究為未來的臨床研究提供了方向。