張守華，蘇凡優(yōu)，何遠(yuǎn)橋，雷俊，項(xiàng)燈，曾俊權(quán)，曾金娣，諶衛(wèi)龍，李匡凡，閻金龍

（1.江西省兒童醫(yī)院普外科, 南昌 330006；2.南昌大學(xué)動(dòng)物科學(xué)部, 南昌 330006；3.井岡山大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤科，吉安 343000；4.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院肝膽外科，南昌 330006）

腎母細(xì)胞瘤是兒童一種最常見(jiàn)的腎臟腫瘤,其發(fā)病率占兒童惡性腫瘤的6%[1]。 手術(shù)+化療的治療方案在過(guò)去10 年間已經(jīng)取得了非常顯著的進(jìn)展,但仍然有10%左右的患者預(yù)后較差。 其原因可能與部分患者對(duì)其化療方案不敏感或者耐藥有關(guān)[1-3]。因此，術(shù)后篩選以及對(duì)患者進(jìn)行敏感、有效的個(gè)體化治療方案已經(jīng)成為目前研究的焦點(diǎn)。

由于腫瘤異質(zhì)性的特點(diǎn)及其自身微環(huán)境的差異， 使得不同患者對(duì)相同的化療方案的敏感性和效果具有顯著的差異[4]。 因此，如何預(yù)測(cè)不同的個(gè)體腫瘤對(duì)化療藥物的敏感性， 有效地篩選并應(yīng)用抗腫瘤藥，成為目前迫切需要解決的問(wèn)題。 本文應(yīng)用“果凍”藥敏檢測(cè)法對(duì)腎母細(xì)胞瘤個(gè)體化治療方法進(jìn)行了初步研究[5]。

1 對(duì)象與方法

1.1 腫瘤樣本 腫瘤樣本均來(lái)自江西省兒童醫(yī)院。經(jīng)手術(shù)切除的腎母細(xì)胞瘤標(biāo)本， 取樣后快速裝入含有組織保存液的50 mL 無(wú)菌離心管中， 在2 h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室， 樣本運(yùn)輸裝置內(nèi)預(yù)先放入足夠的冰塊，在整個(gè)過(guò)程樣本處在低溫環(huán)境中。 腫瘤樣本納入標(biāo)準(zhǔn)：通過(guò)手術(shù)獲取原位腫瘤組織標(biāo)本，所納入患者術(shù)后均需化療。

1.2 材料及試劑 “果凍”藥敏檢測(cè)試劑盒（均購(gòu)自南昌樂(lè)悠生物科技有限公司），MTT （均購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司），樣本保存液、順鉑（齊魯制藥有限公司），伊立替康（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司），二甲基亞砜（DMSO）、環(huán)磷酰胺（江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司），紫杉醇（?？谑兄扑帍S有限公司），長(zhǎng)春新堿（鄭州恒峰藥業(yè)有限公司），依托泊苷（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司），阿霉素（輝瑞制藥（無(wú)錫）有限公司），奧沙利鉑（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司）。

1.3 腫瘤樣本處理 首先剔除壞死及無(wú)活性的組織，在生物安全柜內(nèi)使用0.4% 的錐蟲(chóng)藍(lán)染液檢測(cè)腫瘤組織的活性，隨后放入含量為0.2% 的碘伏溶液中浸泡，時(shí)間約30 s，然后用3% 雙抗的磷酸鹽緩沖液（PBS）反復(fù)沖洗組織，并沖洗殘留碘伏，最后將腫瘤組織分割成大約2 mm × 2 mm × 2 mm的組織塊。

1.4 組織塊接種 將“果凍”藥敏檢測(cè)試劑盒取出置于冰上，使其處于低溫狀態(tài)，每個(gè)孔內(nèi)加入上述分割后的微組織塊，加入含水凝膠的混合液，使其完全淹沒(méi)微組織塊，然后放入二氧化碳的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育約2～3 h，待水凝膠完全凝固后，每孔加入100 μL 培養(yǎng)基，再次放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.5 藥物處理 在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，將96 孔板中的原培養(yǎng)基棄去， 對(duì)照組加入不含藥物的完全培養(yǎng)基，藥物組加入含有測(cè)試抗腫瘤藥物的完全培養(yǎng)基；兩組均每24 h 更換一次培養(yǎng)液。藥物組和對(duì)照組所用的細(xì)胞培養(yǎng)基的成分完全相同。

1.6 敏感性檢測(cè) 上述藥物組在含有抗腫瘤藥物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)3～7 d 后， 棄去培養(yǎng)基， 用無(wú)菌PBS 洗滌3 次，再向孔中加入MTT 溶液，6 h 后將MTT 溶液棄去，將微組織塊從水凝膠中取出，再放入新的細(xì)胞培養(yǎng)孔中， 然后加入200 μL 二甲基亞砜后震蕩10 min， 從上述培養(yǎng)板中的每個(gè)孔中吸取100 μL 溶液加入新的96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板的板孔中，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔的吸光度（OD）值。

1.7 結(jié)果分析 用酶標(biāo)儀檢測(cè) 在490 nm 波長(zhǎng)處的OD 值。 各組藥物抑制率=（1-藥物組OD 值/對(duì)照組A 值）×100%， 其中根據(jù)MTT 比色法檢測(cè)藥物敏感性的判斷標(biāo)準(zhǔn)為抑制率的30%， 抑制率小于30% 的藥物可視為無(wú)效抗腫瘤藥物。 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 患者一般資料 本次共納入四位患者， 其中1男3 女，平均年齡2.23 歲，均行腫瘤切除術(shù)，術(shù)前未化療，術(shù)后病理診斷均為腎母細(xì)胞瘤，患者均需要接受化療。

2.2 MTT 比色法結(jié)果及藥物抑制率 微組織腫瘤塊加入MTT 液6 h 后加入DMSO 呈現(xiàn)顯色反應(yīng)，組織活性越差其顯色約淺， 反之腫瘤組織活性越好顏色越深（圖1）。 經(jīng)MTT 液顯色后通過(guò)計(jì)算不同給藥組的藥物抑制率，臨界值為30%，高于30%判定為有效，低于30%判定為無(wú)效。 四位患者腫瘤抑制率如下表1 所示。

表1 患者腫瘤抑制率

圖1 MTT 比色法結(jié)果顯示藥物抑制率

3 討論

相關(guān)研究證實(shí)腫瘤的異質(zhì)性及不同腫瘤微環(huán)境的個(gè)體差異是影響腫瘤化療敏感性的關(guān)鍵因素， 也是導(dǎo)致不同個(gè)體間對(duì)相同化療方案的化療效果存在差異的重要因素[6-7]。 盡管在大多數(shù)腫瘤治療中存在不同的化療方案， 但臨床醫(yī)師往往難以在多種化療方案中選擇患者敏感的方案， 從而導(dǎo)致治療效果不確切，無(wú)法對(duì)患者進(jìn)行精準(zhǔn)治療。目前常用的藥物敏感性檢測(cè)模型主要為永生化的細(xì)胞系模型及細(xì)胞系構(gòu)建的腫瘤動(dòng)物模型， 二者皆與患者腫瘤具體差異較大， 后者雖然能客觀地反映患者腫瘤的異質(zhì)性，但其耗時(shí)長(zhǎng)且花費(fèi)高。 本實(shí)驗(yàn)直接采用患者的腎母細(xì)胞瘤組織， 有效地克服了藥物篩選中腫瘤的異質(zhì)性與腫瘤微環(huán)境不一致的情況。 在傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的基礎(chǔ)上創(chuàng)新性地加入了水凝膠成分， 利用水凝膠提供的三維立體空間環(huán)境更好地保護(hù)了腎母細(xì)胞腫瘤微組織塊的活性， 并保留了腫瘤的微環(huán)境， 此法被稱(chēng)之為“果凍”藥敏檢測(cè)法[8]。 通過(guò)“果凍”法進(jìn)行化療藥物敏感性的篩選， 其結(jié)果更能準(zhǔn)確地反映臨床患者對(duì)不同化療藥物的反應(yīng)。 值得注意的是，從腫瘤獲取到藥物敏感性檢測(cè)結(jié)束的整個(gè)過(guò)程，操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)較短，費(fèi)用相對(duì)更低。

目前臨床上腎母細(xì)胞瘤的化療藥物主要包括鉑類(lèi)、阿霉素、依托泊苷、環(huán)磷酰胺、長(zhǎng)春新堿、伊立替康等[9-10]。 本研究中所用的藥物方案主要是依據(jù)臨床常用方案進(jìn)行的選擇。 雖然近年來(lái)腎母細(xì)胞瘤的化療效果已經(jīng)取得了顯著進(jìn)展， 但仍然有部分患者對(duì)化療藥物不敏感[1-3]。 在本研究中4 例患者在使用紫杉醇后的腫瘤抑制率分別為55%、48%、62%和84%， 表明紫杉醇具有顯著的腫瘤抑制效果； 這可能是因?yàn)樽仙即甲鳛榧?xì)胞周期抑制劑，能夠同時(shí)抑制體內(nèi)、外的腫瘤細(xì)胞[11]。順鉑的腫瘤抑制率也比較高， 其抑制率分別為36%、41%、24%及34%，但是順鉑很容易出現(xiàn)耐藥性。 盡管在本次實(shí)驗(yàn)中患者對(duì)紫杉醇和順鉑敏感，但在用藥選擇上仍以臨床方案為主，如出現(xiàn)耐藥等情況，再考慮根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇包含相應(yīng)敏感藥物的方案。 然而四例患者對(duì)環(huán)磷酰胺均未表現(xiàn)出敏感性， 這可能是由于環(huán)磷酰胺需要先在肝臟經(jīng)酶轉(zhuǎn)化成4-羥基環(huán)磷酰胺，再經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的轉(zhuǎn)化發(fā)揮抗腫瘤作用，單獨(dú)在體外沒(méi)有抗腫瘤活性[12]。也不排除是藥物自身代謝途徑的影響。 值得注意的是，四例患者對(duì)腎母細(xì)胞瘤最常用的藥物長(zhǎng)春新堿也未能表現(xiàn)出良好的反應(yīng)。

本研究通過(guò)四例樣本的篩選結(jié)果， 發(fā)現(xiàn) “果凍”藥敏檢測(cè)法具有經(jīng)濟(jì)、快速且藥敏結(jié)果與臨床化療方案療效一致性較高的優(yōu)勢(shì)，但是“果凍”藥敏檢測(cè)法也具有如下不足之處：首先，本研究的樣本量相對(duì)較少，尚缺乏足夠的數(shù)據(jù)支撐研究結(jié)論；其次，作為一種體外的腫瘤藥物篩選法，“果凍”藥敏檢測(cè)法對(duì)于需要進(jìn)行體內(nèi)代謝才能發(fā)揮腫瘤作用的藥物如環(huán)磷酰胺評(píng)估欠佳。 最后，尚未將此藥篩結(jié)果用于臨床患者治療， 其臨床應(yīng)用效果有待于進(jìn)一步評(píng)估。 而且4 例腎母細(xì)胞瘤患者依據(jù)上述方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化療方案的藥物敏感性檢測(cè)，其結(jié)果表現(xiàn)出極大的個(gè)體化和差異性。 本身即說(shuō)明了化療方案因“瘤”而異的必要性。 總之，這表明“果凍”藥敏檢測(cè)法用于腫瘤化療藥物篩選具有可行性依據(jù)，同時(shí)該方法簡(jiǎn)單、快速，用于腎母細(xì)胞瘤術(shù)后化療藥物的初步篩選具有很大的優(yōu)勢(shì)，在腎母細(xì)胞瘤個(gè)體化的治療方案應(yīng)用中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。