鐘 娟，初奕杉，王曉艷，李桂伍，張 平

（湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410081）

羊肚菌是羊肚菌屬（Morchella） 所有真菌的統(tǒng)稱(chēng)，是一類(lèi)珍稀食用和藥用真菌，具有重要的經(jīng)濟(jì)和科研價(jià)值[1]。多基因聯(lián)合分子系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究表明，羊肚菌屬可分為3大類(lèi)群，分別為黑色羊肚菌類(lèi)、黃色羊肚菌類(lèi)和變紅羊肚菌類(lèi)[2-6]。近年來(lái)，我國(guó)的羊肚菌栽培產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，2019年～2021年全國(guó)羊肚菌栽培面積近10 000 hm2[7]。栽培成功的主要為黑色羊肚菌類(lèi)的一些物種，如梯棱羊肚菌（M.importuna）、六妹羊肚菌（M.sextelata）、七妹羊肚菌（M.eximia）、頭絲羊肚菌（M.exuberans）、歐氏羊肚菌（M.oweri）、Mel-13和Mel-21，其中梯棱羊肚菌的栽培最廣泛[8-10]。

有研究表明，梯棱羊肚菌有性生殖方式為異宗交配[11]。需要2個(gè)交配型基因相配的細(xì)胞核發(fā)生融合后才能完成有性生殖，進(jìn)而形成子囊果即子實(shí)體。菌種是羊肚菌栽培的基礎(chǔ)，只有當(dāng)菌種同時(shí)具有2種交配型時(shí)，才能保證有性生殖的進(jìn)行和子實(shí)體的產(chǎn)生。

食用菌菌種分離常用的方法有單孢分離法、多孢分離法、組織分離法、基質(zhì)菌絲分離法[12]。目前在羊肚菌生產(chǎn)中采用的多為單孢法、多孢法和組織法，基質(zhì)菌絲分離法很少被采用。不同分離方法獲得的菌種的交配型有所不同，有研究表明單孢法分離的羊肚菌菌株大部分只具有一種交配型（MAT1-1-1或MAT1-2-1）[13-14]，還有研究表明羊肚菌組織分離獲得的菌株存在交配型基因缺失現(xiàn)象[15]。

通過(guò)研究采用組織分離法、單孢分離法和多孢分離法3種不同方式分別獲得梯棱羊肚菌的菌種，后采用PCR擴(kuò)增的方法檢測(cè)其交配型基因。此外，研究多次繼代培養(yǎng)對(duì)多孢菌絲體交配型的影響。研究結(jié)果旨在為梯棱羊肚菌的栽培生產(chǎn)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 供試子實(shí)體

試驗(yàn)所用材料：栽培于湖南師范大學(xué)真菌研究室羊肚菌栽培基地的梯棱羊肚菌子實(shí)體，由2014年采集的野生梯棱羊肚菌（MHHNU 7946）馴化得到。

培養(yǎng)基類(lèi)型：PDA培養(yǎng)基，配方為馬鈴薯200 g·L-1、葡萄糖 20 g·L-1、MgSO42 g·L-1、瓊脂 18 g·L-1。

試驗(yàn)所需儀器設(shè)備：Motic BA210生物顯微鏡，麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；Hirayama HVE-50高壓滅菌鍋，日本Hirayama平山制作所株式會(huì)社；DK-98-IIA恒溫水浴鍋，天津泰斯特儀器有限公司；AUY120電子分析天平，日本島津集團(tuán)；2.5 μL、10 μL、100 μL、1 000 μL 移液槍、Centrfuge5425 高速離心機(jī)和Mastercycler?nexus PCR擴(kuò)增儀，均為艾本德中國(guó)有限公司生產(chǎn)；JY300E電泳儀，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；ChemiDoc MP凝膠成像系統(tǒng)，伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品公司；單孢分離器等。

試驗(yàn)所用試劑：Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒（產(chǎn)品編號(hào)B518259-0100），生工生物工程（上海） 股份有限公司；2×Es Taq MasterMix、6×Loading buffer、DL 2 000 Marker和引物，均訂購(gòu)于北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司；TAE電泳緩沖液等。

1.2 菌種分離

組織分離法：用該方法進(jìn)行了5次重復(fù)取樣，即選取5個(gè)個(gè)體健壯、無(wú)病蟲(chóng)害的羊肚菌子實(shí)體。將無(wú)菌單蒸水沖洗過(guò)的子實(shí)體縱向剖開(kāi)，用滅菌手術(shù)刀分別從菌蓋內(nèi)側(cè)和菌柄內(nèi)側(cè)削取0.5 cm左右的小塊菌肉組織，置于PDA平板培養(yǎng)基中間位置；每個(gè)培養(yǎng)皿只放1塊菌肉，共轉(zhuǎn)接了10個(gè)培養(yǎng)皿；于20℃恒溫箱培養(yǎng)，待培養(yǎng)皿中長(zhǎng)出菌落后轉(zhuǎn)接至試管斜面培養(yǎng)基上。共對(duì)10個(gè)無(wú)污染的組織進(jìn)行了菌種分離，其中5個(gè)分離自菌蓋內(nèi)側(cè)，5個(gè)分離自菌柄內(nèi)側(cè)。

單孢分離法：由一個(gè)孢子萌發(fā)的菌絲體是單孢菌株菌絲體，用該方法共對(duì)30個(gè)單孢子進(jìn)行了分離。剪取一塊無(wú)病害的成熟羊肚菌菌蓋組織，用鑷子夾碎，然后轉(zhuǎn)移到裝有玻璃珠和無(wú)菌水的三角瓶中，旋轉(zhuǎn)震蕩制備成孢子懸浮液。用單孢分離器在顯微鏡下分離單孢，具體方法參照參考文獻(xiàn)[16]。將單個(gè)孢子置于平板PDA培養(yǎng)基上，待孢子萌發(fā)長(zhǎng)出菌落，再轉(zhuǎn)接到試管PDA培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)。

多孢分離法：多孢分離采用鉤懸法，具體方法參照參考文獻(xiàn)[12]。切取一塊成熟羊肚菌菌蓋，子實(shí)層朝下掛在鉤上，鉤的另一端掛在三角瓶口上，三角瓶?jī)?nèi)裝有PDA培養(yǎng)基。靜置12 h，待子囊孢子灑落在培養(yǎng)基表面，取出小鉤，繼續(xù)培養(yǎng)2 d～3 d。待孢子萌發(fā)長(zhǎng)出菌絲，再轉(zhuǎn)接到試管斜面培養(yǎng)基上。

1.3 多孢菌絲體的繼代培養(yǎng)

多孢菌絲體生長(zhǎng)到菌落直徑約3 cm時(shí)，在菌落邊緣區(qū)域挑取小塊培養(yǎng)基，連同其上的菌絲一起轉(zhuǎn)接到新的試管斜面培養(yǎng)基上。如此重復(fù)轉(zhuǎn)接，并檢測(cè)每一代菌種的交配型基因。

1.4 菌種的交配型基因檢測(cè)

DNA提?。喝〔煌N分離方法培養(yǎng)5 d的菌種，從斜面培養(yǎng)基上刮取菌核或菌絲用于提取DNA。DNA提取采用試劑盒法，提取方法按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

PCR擴(kuò)增：交配型基因的擴(kuò)增方法參照參考文獻(xiàn)[13]。PCR反應(yīng)體積為25 μL，包括12.5 uL的2×PCR Master Mix、9.5 uL的滅菌雙蒸水，濃度為10 umol·L-1的正反引物各1 uL和1uL的DNA模板。引物 MAT1-1-1F/R （5′-3′）：CCGGTTTATCTTACTGGACTGGTTC/GCTTTCCTCTTCTCTCGTTGCCATA，MAT1-2-1 F/R （5′-3′）：CATCTTATTCTGTTAGCCGCCCATC/TACGTGGTGCTCTCGTGCAGATTTT。反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸45 s～60 s，34個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min；4℃保存。

凝膠電泳檢測(cè)交配型基因：每個(gè)樣品分別用MAT1-1-1和MAT1-2-1引物擴(kuò)增，擴(kuò)增出的MAT1-1-1基因片段約為600 bp，MAT1-2-1基因片段約為1 000 bp。將2次擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物混合，用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳后，置于紫外光透射儀上進(jìn)行觀察拍照，若觀察到目的條帶就說(shuō)明樣品具有相應(yīng)的交配型基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 組織分離菌種的交配型基因分布情況

組織分離法共分離得到10個(gè)菌絲體，其中5個(gè)分離自菌蓋內(nèi)側(cè)組織，經(jīng)檢測(cè)均只具有單一交配型基因MAT1-1-1，另外5個(gè)菌株分離自菌柄內(nèi)側(cè)組織，也只檢測(cè)到單一交配型MAT1-1-1。

2.2 單孢分離菌種的交配型基因分布情況

單孢分離法得到30個(gè)梯棱羊肚菌子囊孢子，其中21個(gè)孢子萌發(fā)產(chǎn)生菌落，其中14個(gè)菌株為MAT 1-1-1交配型基因，7個(gè)菌株為MAT1-2-1交配型基因。由此可知含MAT1-1-1交配型基因的菌株數(shù)量是含MAT1-2-1交配型基因的菌株的2倍。

2.3 多孢分離菌種的交配型基因分布情況

此方法共得到6個(gè)多孢菌絲體，分別編號(hào)為MS-1～MS-6，經(jīng)檢測(cè)這 6個(gè)菌絲體均同時(shí)具有MAT1-1-1和MAT1-2-1兩種交配型基因。

2.4 多孢分離菌種多次傳代后交配型的變化

對(duì)2.3中6個(gè)多孢菌絲體進(jìn)行多次轉(zhuǎn)接繼代培養(yǎng)，共轉(zhuǎn)接了23代。每轉(zhuǎn)接一代分別檢測(cè)其交配型，試驗(yàn)連續(xù)3代確認(rèn)MAT1-1-1或MAT1-2-1交配型丟失后不再繼續(xù)檢測(cè)，其結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知，其中MS-1、MS-3、MS-4菌株在轉(zhuǎn)接到第6代時(shí)，其交配型基因MAT1-2-1發(fā)生丟失，只剩下MAT1-1-1交配型基因；MS-2在第9代丟失了MAT1-1-1交配型基因；MS-6在第11代丟失了MAT1-1-1交配型基因；MS-5在繼代培養(yǎng)了23代后仍存在MAT1-1-1和MAT1-2-1兩種交配型基因。

表1 多孢分離菌種繼代培養(yǎng)后交配型基因檢測(cè)結(jié)果Tab.1 Mating type genes results of the subcultures of multi-spore strains

3 結(jié)論討論

3.1 梯棱羊肚菌子實(shí)體的交配型分布

目前人工栽培的食用菌大多屬于擔(dān)子菌，而梯棱羊肚菌屬于子囊菌，其子實(shí)體的交配型分布情況較為復(fù)雜。杜習(xí)慧等[10-11]對(duì)梯棱羊肚菌子實(shí)體進(jìn)行了交配型分布檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)多數(shù)栽培樣品的菌柄和子實(shí)層均由2種交配型構(gòu)成；而野生樣品交配型分布則不同，僅子實(shí)層（可育組織）含2種交配型，而菌柄（不育組織）僅能檢測(cè)到1種交配型。在本研究中，無(wú)論是從菌蓋內(nèi)壁還是從菌柄內(nèi)壁進(jìn)行組織分離取材，所得菌株都只有MAT1-1-1一種交配型。菌蓋外表面的組織要產(chǎn)生子囊和子囊孢子，必須同時(shí)具有MAT1-1-1和MAT1-2-1兩種交配型基因。已有報(bào)道分析，羊肚菌有3種不同交配型基因分布方式：菌柄和菌蓋均有2種交配型基因，菌蓋有2種交配型基因而菌柄只有MAT1-1-1交配型基因，以及菌柄和菌蓋均只有MAT1-1-1[11]。再結(jié)合相關(guān)研究進(jìn)行分析，認(rèn)為供試子實(shí)體的交配型分布方式為：菌蓋外層同時(shí)具有MAT1-1-1和MAT1-2-1兩種交配型，菌蓋內(nèi)層只有MAT1-1-1一種交配型；而菌柄的內(nèi)層和外層均只有MAT1-1-1一種交配型。目前對(duì)羊肚菌交配型基因研究都只對(duì)菌柄或菌蓋進(jìn)行檢測(cè)，而鮮有同時(shí)針對(duì)菌蓋內(nèi)側(cè)、外側(cè)，菌柄內(nèi)側(cè)、外側(cè)的交配型基因檢測(cè)。本研究提供了更加精準(zhǔn)的梯棱羊肚菌子實(shí)體的交配型分布圖。當(dāng)然，研究的供試子實(shí)體來(lái)自同一個(gè)栽培基地，其他產(chǎn)地栽培出的梯棱羊肚菌子實(shí)體的交配型分布情況如何有待進(jìn)一步研究。組織分離是食用菌菌種分離的常用方法之一，出于無(wú)菌的考慮，在羊肚菌組織分離過(guò)程中通常是將子實(shí)體剖開(kāi)，從子實(shí)體內(nèi)表面取材。結(jié)果可能導(dǎo)致分離到的菌種只有一種交配型。劉偉等[15]在進(jìn)行羊肚菌組織分離時(shí)也發(fā)現(xiàn)獲得的菌種有一部分只檢測(cè)到一種交配型基因。

3.2 梯棱羊肚菌菌種的交配型基因丟失現(xiàn)象

已有研究發(fā)現(xiàn)梯棱羊肚菌菌種會(huì)發(fā)生交配型基因丟失現(xiàn)象[13]，即原本同時(shí)具有MAT1-1-1和MAT1-2-1兩種交配型基因的菌種經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)接后，只能檢測(cè)出其中的一種交配型。但對(duì)于交配型基因丟失的原因尚不清楚。本研究中分離出的6個(gè)多孢菌絲體在第一代時(shí)均檢測(cè)到MAT1-1-1和MAT1-2-1兩種交配型基因。但是，將這6個(gè)菌株進(jìn)行多次轉(zhuǎn)接，其中3個(gè)菌株在轉(zhuǎn)接到第6代時(shí)，丟失了交配型MAT1-2-1，有2個(gè)菌株分別在轉(zhuǎn)接到第9代和第11代時(shí)丟失了交配型MAT1-1-1，僅有1個(gè)菌株在經(jīng)過(guò)23次轉(zhuǎn)接后依然具有MAT1-1-1和MAT1-2-1兩種交配型。因此認(rèn)為梯棱羊肚菌的多孢菌絲體最初包含了多個(gè)子囊孢子萌發(fā)產(chǎn)生的菌絲，雖然單個(gè)子囊孢子只具有1種交配型，但1支試管中具有多個(gè)孢子萌發(fā)產(chǎn)生的菌絲，即多孢分離法獲得的1個(gè)菌株是多個(gè)不同孢子萌發(fā)產(chǎn)生的菌絲混合物。當(dāng)對(duì)整支試管（菌種） 的交配型進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，往往可以檢測(cè)到2種交配型。這些由不同孢子萌發(fā)產(chǎn)生的菌絲在試管中只是混合生長(zhǎng)在一起，并沒(méi)有發(fā)生融合。菌絲在斜面培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度和生長(zhǎng)方向各不相同，在菌種轉(zhuǎn)接時(shí)一般從菌落邊緣挑取尖端菌絲。經(jīng)過(guò)反復(fù)幾次的操作，可能就只挑取到某一孢子產(chǎn)生的菌絲，這時(shí)檢測(cè)其交配型也就只能檢測(cè)到一種交配型。但這種情況下發(fā)生交配型丟失應(yīng)屬人為操作丟失，而不屬于菌種自身原因造成的交配型基因丟失。

劉萍等[14]用207對(duì)具有不同交配型的梯棱羊肚菌菌株進(jìn)行對(duì)峙培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)只有1對(duì)表現(xiàn)出營(yíng)養(yǎng)體親和，說(shuō)明營(yíng)養(yǎng)體（菌絲）不親和性在梯棱羊肚菌單孢菌株間普遍存在。同時(shí)還還發(fā)現(xiàn)在供試的6個(gè)多孢菌絲體中，有1個(gè)菌株在轉(zhuǎn)接23代后依然具有MAT1-1-1和MAT1-2-1兩種交配型。產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因可能有以下3個(gè)方面：1）轉(zhuǎn)接的代數(shù)還不夠，若轉(zhuǎn)接更多代，最終還是會(huì)出現(xiàn)交配型基因丟失；2）在減數(shù)分裂過(guò)程中偶爾發(fā)生錯(cuò)誤，2個(gè)交配型不同的細(xì)胞核到同一個(gè)子囊孢子中，這樣的孢子長(zhǎng)出的菌絲就具有2種交配型，并且不會(huì)隨著傳代而發(fā)生丟失；3）具有不同交配型的菌絲偶爾發(fā)生了融合，融合后的菌絲具有2種交配型，也不會(huì)隨著傳代而發(fā)生丟失。

3.3 對(duì)梯棱羊肚菌栽培生產(chǎn)的指導(dǎo)意義

目前，羊肚菌人工栽培產(chǎn)業(yè)在我國(guó)發(fā)展迅速，但在一些栽培基地會(huì)出現(xiàn)出菇少或不出菇的現(xiàn)象[7-9]，給菇農(nóng)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重阻礙了產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。造成出菇少或不出菇的因素有多種，除氣候因素和栽培管理技術(shù)的影響外，還有一個(gè)重要原因就是菌種交配型基因的缺失。梯棱羊肚菌為異宗結(jié)合的真菌，栽培使用的菌種必須同時(shí)具有2種交配型，才能保證子實(shí)體的形成。研究結(jié)果表明，組織分離的梯棱羊肚菌菌種只有一種交配型，若實(shí)際應(yīng)用中使用這樣的菌種，很有可能導(dǎo)致不出菇。單孢分離的菌種也只有一種交配型，若使用一個(gè)單孢菌種進(jìn)行栽培，也可能導(dǎo)致不出菇。但如果將2個(gè)或多個(gè)具有不同交配型的單孢菌種搭配使用，能在一定程度上減少不出菇的風(fēng)險(xiǎn)。

多孢分離的菌株雖然具有2種交配型，但轉(zhuǎn)接次數(shù)太多會(huì)導(dǎo)致某一交配型丟失，因此生產(chǎn)中使用的多孢菌絲體一旦育成新品種，其菌種應(yīng)該以冷藏或冷凍的方式進(jìn)行保藏，避免多次傳代，最好每年重新分離。無(wú)論是哪種方法分離的菌種，在大規(guī)模投入使用前都必須進(jìn)行交配型基因檢測(cè)。交配型基因檢測(cè)應(yīng)該成為制種單位對(duì)梯棱羊肚菌菌種進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)的指標(biāo)之一。