邵廣晴

(萬(wàn)博科技職業(yè)學(xué)院，安徽 合肥 230031)

0 引言

宣痹通絡(luò)顆粒主要是由徐長(zhǎng)卿、羌活、 獨(dú)活、當(dāng)歸、川芎、乳香(制)、沒(méi)藥(制)等十二味中藥材，經(jīng)過(guò)提取、加工等一系列工序而制成的中藥顆粒劑，用于活血通絡(luò)，散寒除濕，消腫止痛等。方中徐長(zhǎng)卿性辛，溫，歸肝、胃經(jīng)；其根莖呈不規(guī)則柱狀，有盤(pán)節(jié)，斷面中空；表面淡黃白色至淡棕黃色或棕色，具有微細(xì)的縱皺紋，并有纖細(xì)的須根；質(zhì)脆，易折斷，斷面粉性，皮部類(lèi)白色或黃白色；氣香，味微辛涼，具有祛風(fēng)止癢，利水消腫，活血止痛等功效[1]，用于風(fēng)濕痹痛，胃痛脹滿(mǎn)，牙痛，腰痛，跌撲傷痛，在《神農(nóng)本草經(jīng)》中被列為上品?，F(xiàn)代藥理研究表明[2]，徐長(zhǎng)卿內(nèi)含丹皮酚、黃酮苷、多糖類(lèi)、揮發(fā)油及少量的生物堿和維生素等多種成分，具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抑菌、抗炎等多種藥理作用[3-4]。因此，對(duì)宣痹通絡(luò)顆粒中有效成分丹皮酚的含量測(cè)定方法進(jìn)行研究。丹皮酚(C9H10O3)，化學(xué)名2＇-羥基-4＇-甲氧基苯乙酮，有特異臭，味微辣，在甲醇或乙醇中易溶，在水中不溶。中國(guó)藥典2020版記載徐長(zhǎng)卿的含量測(cè)定方法為高效液相色譜法，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以甲醇-水(45∶55)為流動(dòng)相，理論塔板數(shù)按丹皮酚峰計(jì)不低于3 000[5]。在實(shí)驗(yàn)中，同樣采取高效液相色譜法，并以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(Agilent Eclipse XDB-C184.6×250 mm,5 μm)。為了取得較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，調(diào)整流動(dòng)相為乙腈-水（35∶65），檢測(cè)波長(zhǎng)274 nm，理論塔板數(shù)不低于5 000為條件，進(jìn)行丹皮酚含量測(cè)定。并驗(yàn)證此法用于宣痹通絡(luò)顆粒中丹皮酚含量測(cè)定是否準(zhǔn)確可靠。結(jié)果表明，本方法操作簡(jiǎn)便，重復(fù)性好，準(zhǔn)確度高。

1 試驗(yàn)藥品及主要儀器

1.1 儀器

LC-10AT高效液相色譜儀，SPD-10A 紫外檢測(cè)器，LC solution色譜工作站，ADVENTURER (AR1140)電子天平(1/10 000)；METTLER TOLEDO(AB135S)電子天平(1/100 000)。

1.2 試藥

宣痹通絡(luò)顆粒樣品：由安徽九方藥物研究院有限公司提供，批號(hào)：20210812，20210814，20210816。丹皮酚對(duì)照品：110708-201908，中國(guó)藥品生物制品檢定所。實(shí)驗(yàn)中所使用的其他試劑均是色譜純或分析純。

2 方法

2.1 色譜條件

采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(Agilent Eclipse XDB-C184.6×250 mm,5 μm)；乙腈-水(35∶65)為流動(dòng)相；流速為 1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng) 274 nm；柱溫 25 ℃；進(jìn)樣體積為 10 μL。按丹皮酚峰計(jì)算，理論塔板數(shù)不低于5 000。

2.2 樣品溶液的制備和測(cè)定

2.2.1 對(duì)照品溶液制備

取丹皮酚對(duì)照品7.29 mg，精密稱(chēng)定，放置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解后精密量取1 mL溶液，放置于10 mL 量瓶中，再次用甲醇稀釋至刻度，搖勻，最后用0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.2.2 供試品溶液制備

取宣痹通絡(luò)顆粒約2.0 g，精密稱(chēng)定，置于具塞錐形瓶中。精密量取 25 mL 80%乙醇溶液加入瓶中，稱(chēng)定重量。加熱回流30 min，放冷后再次稱(chēng)定重量。兩次稱(chēng)定減失的重量用80%乙醇補(bǔ)足，搖勻后濾過(guò)。精密量取1 mL續(xù)濾液放置于5 mL的量瓶中，加入流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻后過(guò)濾，即得。

2.2.3 陰性樣品試驗(yàn)

根據(jù)上述供試品溶液的制備方法，用以制備不含徐長(zhǎng)卿成分的陰性樣品溶液，并根據(jù)上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定分析。

在對(duì)照品對(duì)應(yīng)位置無(wú)明顯其他峰的出現(xiàn)。結(jié)果表明：陰性樣品對(duì)丹皮酚的測(cè)定無(wú)干擾。

2.2.4 含量測(cè)定方法

分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀中，測(cè)定并記錄色譜圖。根據(jù)外標(biāo)法按峰面積計(jì)算，即得。

3 結(jié)果

3.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取丹皮酚對(duì)照品溶液，注入液相色譜儀中，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄每次峰面積、保留時(shí)間、拖尾因子、理論板數(shù)。通過(guò)分析和計(jì)算，丹皮酚對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，得到的平均保留時(shí)間為25.324 min，RSD=0.34%。

平均峰面積為2 167 708，其峰面積(S)測(cè)量值相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.11%(不大于2.0%)，分離度R=2.349＞1.5。平均理論板數(shù)為12 746.167，RSD=0.92%。

平均拖尾因子為1.077，RSD=0.36%。結(jié)果表明：本法的系統(tǒng)適用性良好，并將理論板數(shù)定為不少于5 000為宜。

3.2 線(xiàn)性關(guān)系

精密量取適量的丹皮酚對(duì)照品濃配液，加入甲醇，分別稀釋2倍、5倍、10倍、25倍、50倍，搖勻后作為供試品溶液。分別吸取10 μL上述各稀釋倍數(shù)的供試品溶液，注入高效液相色譜儀，測(cè)定并記錄峰面積[6]。

用對(duì)照品峰面積(Y)回歸丹皮酚對(duì)照品濃度(X)，得 回歸 方 程：Y=101 942X+23 912，相 關(guān) 系數(shù)r=1(n=5)，丹皮酚對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如圖1所示。

圖1 丹皮酚對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

結(jié)果表明：丹皮酚對(duì)照品在所試濃度4.208～ 105.200 μg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系。

3.3 精密度試驗(yàn)考察

3.3.1 重復(fù)性試驗(yàn)

按照上述含量測(cè)定方法項(xiàng)下的測(cè)定方法，對(duì)同一批次宣痹通絡(luò)顆粒樣品(20210812批)，分別測(cè)定6次，記錄色譜圖，計(jì)算含量(mg/g)、SD(%)及RSD(%)[7]。 通過(guò)計(jì)算得：6次含量測(cè)定的結(jié)果分別為：1.08、 1.08、1.09、1.09、1.08、1.08 mg/g，X=1.08 mg/g，SD=0.01%，RSD=0.59%。結(jié)果表明：該法重復(fù)性良好。

3.3.2 中間精密度試驗(yàn)

對(duì)同一批次宣痹通絡(luò)顆粒樣品(20210812批)由兩人在不同時(shí)間、不同儀器上分別進(jìn)行6次含量測(cè)定，兩人測(cè)得含量(mg/g)數(shù)據(jù)結(jié)果如表1所示。

表1 中間精密度試驗(yàn)結(jié)果 單位：mg/g

通過(guò)數(shù)據(jù)分析，第一人對(duì)20210812批次宣痹通絡(luò)顆粒樣品進(jìn)行的6次含量測(cè)定的平均含量為1.08 mg/g，SD=0.01%，RSD=0.59%。第二人對(duì)同批次宣痹通絡(luò)顆粒樣品進(jìn)行的6次含量測(cè)定的平均含量為1.07 mg/g，SD=0.01%，RSD=0.77%。結(jié)果表明：本法具有良好的中間精密度。

3.3.3 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別取對(duì)照品溶液與供試品溶液在0、2、4、6、8、10 h進(jìn)行進(jìn)樣，測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算RSD(%)值[8]，結(jié)果如表2和表3所示。

表2 對(duì)照品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

表3 供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

結(jié)果表明：在所試10 h內(nèi)樣品溶液的穩(wěn)定性良好。

3.3.4 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

稱(chēng)取 1 g同一批號(hào)(20210812批)樣品(含量為1.08 mg/g)，精密稱(chēng)定后放置于具塞錐形瓶中，加入適量丹皮酚對(duì)照品，精密加入25 mL 80%乙醇溶液，稱(chēng)定重量。加熱回流30 min，放冷后再次稱(chēng)定重量。兩次稱(chēng)重減失的重量用80%乙醇溶液補(bǔ)足，搖勻后濾過(guò)。量取續(xù)濾液1 mL放置于5 mL量瓶中，用流動(dòng)相溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，即得。取6份供試品溶液各10 μL注入高效液相色譜儀，測(cè)定并記錄色譜圖[9]， 以峰面積計(jì)算本法的回收率。經(jīng)計(jì)算6份供試品溶液的回收率分別為：99.21%、100.17%、99.91%、98.52%、99.01%、99.49%，

平均回收率為99.39%，RSD為0.61%。結(jié)果表明：該法對(duì)丹皮酚的測(cè)定具有良好的準(zhǔn)確度。

3.3.5 三批樣品的測(cè)定

根據(jù)上述確定的色譜條件及測(cè)定方法，測(cè)定三批宣痹通絡(luò)顆粒(20210812批、20210814批、20210816批)中丹皮酚的含量[10]，結(jié)果如表4所示。

表4 三批樣品的含量測(cè)定結(jié)果

結(jié)果表明：三批宣痹通絡(luò)顆粒樣品中丹皮酚含量均在1.05～1.13 mg/g之間，結(jié)合徐長(zhǎng)卿藥材丹皮酚含量及其轉(zhuǎn)移率，暫定含量限度為：每1 g宣痹通絡(luò)顆粒中徐長(zhǎng)卿以丹皮酚(C9H10O3)計(jì)，不得少于0.80 mg。

4 結(jié)語(yǔ)

(1)在《中國(guó)藥典》2020版三部通則中高效液相色譜法項(xiàng)下記載，流動(dòng)相常用甲醇-水系統(tǒng)或乙腈-水系統(tǒng)。試驗(yàn)分析中，將宣痹通絡(luò)顆粒樣品分別在不同比例的甲醇-水和乙腈-水為流動(dòng)相的色譜儀中進(jìn)行分析比較，發(fā)現(xiàn)宣痹通絡(luò)顆粒樣品在甲醇和乙腈中均具有較好的溶解性能，但使用乙腈-水為流動(dòng)相時(shí)，色譜儀記錄的色譜峰有較好的峰形，峰寬也較窄，有利于提高柱效。另外采用紫外檢測(cè)儀進(jìn)行波長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)，乙腈-水系統(tǒng)效果更佳。綜合各方面的考慮，在宣痹通絡(luò)顆粒樣品丹皮酚含量試驗(yàn)中我們確定使用乙腈-水(35：65)為流動(dòng)相進(jìn)行丹皮酚含量測(cè)定。

(2)研究中采用SPD-10A紫外檢測(cè)器對(duì)丹皮酚在190～400 nm波長(zhǎng)范圍測(cè)定丹皮酚在不同波長(zhǎng)處的吸光度，并繪制其吸光度與波長(zhǎng)的關(guān)系圖，結(jié)果顯示在274 nm處丹皮酚對(duì)照品溶液有最大吸收，因此選擇紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為274 nm。

(3)溫度會(huì)影響高效液相色譜儀的分離效果，在溫度選擇時(shí)，綜合考慮色譜儀的分離效果和實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)的實(shí)際情況，選定在室溫25 ℃進(jìn)行宣痹通絡(luò)顆粒樣品中丹皮酚的含量測(cè)定。

(4)在研究過(guò)程中不斷優(yōu)化供試品處理方法，以不同濃度乙醇溶液，進(jìn)行提取比較；并采用回流提取和超聲波提取方法進(jìn)行對(duì)比。最終選擇80%乙醇作為提取溶媒，采用加熱回流的提取方式進(jìn)行提取。結(jié)果：樣品及對(duì)照品基線(xiàn)較好，樣品中丹皮酚峰與相鄰各雜質(zhì)峰分離較好。

(5)本方法操作簡(jiǎn)便，重復(fù)性好，精密度、準(zhǔn)確度高。通過(guò)多批次樣品的驗(yàn)證，可用于評(píng)價(jià)宣痹通絡(luò)顆粒質(zhì)量的穩(wěn)定性。