秦 菊 江 濱 周春根

復(fù)雜性肛瘺是指術(shù)后易導(dǎo)致肛門失禁的肛瘺，包括瘺管穿越肛門外括約肌30%以上的肛瘺(高位括約肌間肛瘺、括約肌上肛瘺和括約肌外肛瘺)、女性前側(cè)肛瘺以及復(fù)發(fā)性肛瘺或先前存在大便失禁的肛瘺，炎癥性腸病或放射引起的肛瘺等[1]。手術(shù)干預(yù)是臨床主要治療方式，治療關(guān)鍵在于消除內(nèi)口及與內(nèi)口相通的瘺管，最大可能減少對肛門括約肌損傷。但由于內(nèi)口位置及瘺管走行與括約肌關(guān)系復(fù)雜，切開掛線等傳統(tǒng)手術(shù)創(chuàng)面大、恢復(fù)慢，術(shù)后患者生活質(zhì)量下降，肛門功能常易受影響，肛門失禁率發(fā)生較高。因此在盡可能減少創(chuàng)傷、保護(hù)肛門功能的前提下，提高復(fù)雜性肛瘺治愈率既是臨床治療復(fù)雜性肛瘺的難點(diǎn)。

脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)是從脂肪組織中分離提取而得到的一種具有自我更新及多向分化潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞，具有組織再生與修復(fù)、抑制炎性反應(yīng)及免疫調(diào)節(jié)等功能。與骨髓、臍帶等其他來源的間充質(zhì)干細(xì)胞比較，ADSCs來源廣泛、取材簡便、可塑性強(qiáng)，免疫原性更低[2]。目前已廣泛應(yīng)用于退行性疾病、組織修復(fù)與重建、免疫系統(tǒng)等相關(guān)疾病的預(yù)防和治療[3,4]。江濱等[5]將ADSCs用于復(fù)雜性肛瘺的治療，其安全性和有效性均得到了證實(shí)。然而其作用機(jī)制仍不明確，因此，本文對ADSCs治療復(fù)雜性肛瘺的機(jī)制進(jìn)行探討，詳見圖1。

圖1 ADSCs治療復(fù)雜性肛瘺的可能機(jī)制

一、ADSCs生物學(xué)特性

1.增殖：ADSCs是一種多能干細(xì)胞，具有很強(qiáng)的增殖能力。研究發(fā)現(xiàn)，ADSCs在體外培養(yǎng)的2～5天增殖迅速，呈對數(shù)式增殖，且增殖速度較其他間充質(zhì)干細(xì)胞更快，經(jīng)100代增殖擴(kuò)增后仍能保持正常的二倍體核型，性質(zhì)仍能保持相對穩(wěn)定[6]。與骨髓、臍帶等其他來源間充質(zhì)干細(xì)胞比較，ADSCs能更長時(shí)間在體外維持其生物學(xué)特性。因此，增殖迅速、體外活性持久可能是ADSCs發(fā)揮治療作用的前提和基礎(chǔ)。

2.分化：ADSCs具有干細(xì)胞所共有的“干性”，能在不同的誘導(dǎo)條件下分化成多種細(xì)胞，如脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞及成纖維細(xì)胞等。目前國內(nèi)已廣泛將其應(yīng)用于免疫系統(tǒng)疾病及損傷、燒傷等創(chuàng)傷修復(fù)性疾病的治療[7]。目前有研究認(rèn)為，ADSCs到達(dá)肛瘺創(chuàng)面后，在創(chuàng)面組織特定微環(huán)境誘導(dǎo)下，通過增殖分化發(fā)育為相應(yīng)組織類型的功能細(xì)胞，而促進(jìn)創(chuàng)面愈合，恢復(fù)肛門功能。但ADSCs能否直接分化替代受損細(xì)胞卻存在爭議，還需進(jìn)一步研究探索。相關(guān)試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，ADSCs移植治療兔肛瘺模型，愈合后的肛門組織充滿了脂肪細(xì)胞及新生毛囊腺[8]。

3.分泌：ADSCs具有自分泌、旁分泌和遠(yuǎn)程分泌等分泌功能，能在不同的誘導(dǎo)條件下分泌不同的細(xì)胞因子[9]。其中，與促進(jìn)創(chuàng)面愈合相關(guān)的因子主要包括：免疫調(diào)節(jié)因子(如PEG、HGF、IDO)，抗凋亡相關(guān)因子(如VEGF、CSF、TGF)，血管生成因子(如VEGF、IGF、bFGF)，細(xì)胞生長因子(如IL-6、SCF、LIF、angiopoietin1)及趨化因子(如CCL famliy chemokines、CXCL famliy chemokines)等[10]。

除分泌上述細(xì)胞因子外，ADSCs亦能分泌脂肪干細(xì)胞外泌體(adipose-derived stem cells exosome，ADSCs-exos)。目前研究發(fā)現(xiàn)ADSCs-exos與其來源干細(xì)胞有類似的生理功能，更有研究認(rèn)為干細(xì)胞移植的治療作用更多是通過外泌體而發(fā)揮作用[11]。相關(guān)研究證明，體內(nèi)和體外培養(yǎng)的ADSCs都能通過主動(dòng)或被動(dòng)的方式分泌外泌體，大小為30～150nm，富含與修復(fù)再生功能相關(guān)的脂類、蛋白質(zhì)、mRNA、miRNA 及多種生長因子[12, 13]?，F(xiàn)有研究認(rèn)為ADSCs的分泌功能是其發(fā)揮治療作用的主要機(jī)制之一，而ADSCs-exos可能是其發(fā)揮作用的主要介質(zhì)。

二、ADSCs治療復(fù)雜性肛瘺的機(jī)制

1.降低炎性反應(yīng)：過度的創(chuàng)面炎性反應(yīng)可延緩肛瘺創(chuàng)面的愈合，因此減輕炎性反應(yīng)是促進(jìn)復(fù)雜性肛瘺創(chuàng)面愈合的重要一環(huán)。目前相關(guān)研究已證實(shí)，ADSCs能顯著降低創(chuàng)面組織中IL-1、IL-6、IL-8、IL -17、IFN-γ和TNF-α等促炎性細(xì)胞因子的水平，并能同時(shí)增加抗炎性細(xì)胞因子IL-3、IL-4、IL-5、IL-10等的表達(dá)，通過改變免疫細(xì)胞的細(xì)胞因子譜，調(diào)控免疫細(xì)胞的增殖活化從而減輕創(chuàng)面炎性反應(yīng)，其機(jī)制可能與抑制COX-2、PGE2、NF-κB等多種信號通路的活化相關(guān)[14,15]。同時(shí)，ADSCs通過分泌免疫相關(guān)因子，直接作用于免疫細(xì)胞而進(jìn)一步調(diào)控免疫炎性反應(yīng)。如：ADSCs通過分泌PGE2、IDO和s HLA-G5等固有性免疫抑制因子可直接抑制NK細(xì)胞的活化；分泌腫瘤壞死因子α刺激基因-6(TSG-6) 可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表型由M1型(促炎型)轉(zhuǎn)變?yōu)镸2型(抗炎型)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，M2 型巨噬細(xì)胞不僅可分泌IL-10下調(diào)炎性反應(yīng)，同時(shí)亦可誘導(dǎo)STAT3 或其他轉(zhuǎn)錄因子募集而調(diào)節(jié)血管生成及組織重塑[16]。

此外，ADSCs-exos對降低炎性反應(yīng)亦具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，ADSCs-exos可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞由M1型向M2型的轉(zhuǎn)化，其具體作用機(jī)制可能是通過自身攜帶的miRNA影響巨噬細(xì)胞表面的Toll樣受體4的合成而實(shí)現(xiàn)的[17]。另有研究發(fā)現(xiàn)，ADSCs-exos可通過保護(hù)血管屏障的完整性，阻止炎性細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合，從而調(diào)節(jié)受損內(nèi)皮細(xì)胞的炎性反應(yīng)[18]。另外，ADSCs-exos亦可通過高表達(dá)Nrf2而降低 IL-1β、IL-6 和 TNF-α等炎性細(xì)胞因子水平，而降低創(chuàng)面的炎性反應(yīng)[19]。

2.免疫調(diào)節(jié)：ADSCs及ADSCs-exos均具有免疫調(diào)節(jié)作用。ADSCs通過受體-配體相互作用的方式，與T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞等特異性免疫細(xì)胞及巨噬細(xì)胞(Mφs)、NK細(xì)胞、和樹突狀細(xì)胞(DC)等髓系細(xì)胞直接接觸，如阻斷T淋巴細(xì)胞周期、抑制B淋巴細(xì)胞的增殖和分化、影響DC細(xì)胞功能，而進(jìn)一步影響免疫功能[20]。其主要機(jī)制可能與Notch、ERK、MAPK等相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化有關(guān)[21,22]。此外，ADSCs通過分泌與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的細(xì)胞因子，如IL-10、TGF-β、PGE2和NO等，通過影響免疫細(xì)胞活化性受體的表達(dá)對免疫細(xì)胞進(jìn)行調(diào)控[23]。如：ADSCs分泌TGF-β3和TSP1可促進(jìn)M2Mφs極化。同時(shí)，ADSCs-exos miR-223又能夠靶向pknox1調(diào)節(jié)Mφs極化，從而共同實(shí)現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)[24]。故目前有研究認(rèn)為，間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)功能主要是通過產(chǎn)生的可溶性因子及其對免疫細(xì)胞的旁分泌作用來實(shí)現(xiàn)。

3.促進(jìn)血管新生：創(chuàng)面局部充足的循環(huán)灌注是復(fù)雜性肛瘺愈合的必要條件，可促進(jìn)細(xì)胞生長和肉芽組織形成，而充足的循環(huán)灌注受微血管數(shù)量及微血管功能影響。相關(guān)研究認(rèn)為，ADSCs可直接分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞(EC)或通過分泌血管源性生成因子(VEGF、HGF、bFGF、FGF2、TGF-β3)直接誘導(dǎo)EC增殖，促進(jìn)創(chuàng)面肉芽組織生長和毛細(xì)血管網(wǎng)形成，而改善創(chuàng)面血供，促進(jìn)肛瘺修復(fù)[25]；此外，ADSCs通過分泌產(chǎn)生的各類信號因子，如IL、IFN、TNF、CSF、細(xì)胞生長因子、趨化因子等調(diào)節(jié)和改善創(chuàng)面局部微環(huán)境，為創(chuàng)面組織和血管的增殖和生長創(chuàng)造適宜微環(huán)境[26]。

另外，ADSCs-exos在血管形成過程中具有重要作用。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，ADSCs-exos所包含的相關(guān)蛋白或RNA可直接調(diào)控創(chuàng)面組織細(xì)胞基因的表達(dá)來誘導(dǎo)EC的增殖，如：ADSCs-exos所攜帶的miR-126、miR-130a和miR-132等miRNA與血管的形成密切相關(guān)[13,27]。研究證實(shí)，ADSCs-exos攜帶的miR-125a可靶向血管生成抑制因子DLL4的3′非翻譯區(qū)，或促進(jìn)內(nèi)皮間細(xì)胞形成，抑制DLL4表達(dá)，促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)過程中的血管生成[28]。Li等[29]研究發(fā)現(xiàn)，ADSCs-exos可通過lncRNA H19/miR-152-3p/PTEN軸作用，使成纖維細(xì)胞中高表達(dá)miR-152-3p，低表達(dá)lncRNA H19和PTEN，并同時(shí)激活磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸三激酶(PI3K)/蛋白激酶 B(Akt1)信號通路，減少細(xì)胞凋亡，促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)。Wang等[30]研究發(fā)現(xiàn)ADSCs-exos可增加成纖維細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶-3(MMP3)的表達(dá)，調(diào)控Ⅰ/Ⅲ型膠原和彈性蛋白的形成比例，促進(jìn)創(chuàng)面愈合，同時(shí)并可抑制創(chuàng)面瘢痕形成，其作用機(jī)制可能與 ERK/MAPK 通路的活化相關(guān)。促進(jìn)復(fù)雜性肛瘺創(chuàng)面愈合的同時(shí)減少瘢痕組織的形成，是ADSCs治療復(fù)雜性肛瘺的一大亮點(diǎn)和優(yōu)勢，而其具體作用機(jī)制仍待進(jìn)一步研究明確。

三、展 望

近年來，ADSCs的安全性和有效性在臨床上均已被肯定，其具有干細(xì)胞強(qiáng)大的自我增殖更新、多向分化潛能及分泌功能，且來源廣泛、儲(chǔ)量豐富、易獲得，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。目前研究認(rèn)為ADSCs治療復(fù)雜性肛瘺可能是基于ADSCs的增殖、分化及分泌功能，從而進(jìn)一步發(fā)揮抗炎、免疫調(diào)節(jié)和促進(jìn)血管新生等相關(guān)作用，最終實(shí)現(xiàn)肛瘺創(chuàng)面的愈合。目前，ADSCs的免疫調(diào)節(jié)作用是研究的熱點(diǎn)，被認(rèn)為是其發(fā)揮治療作用的主要機(jī)制之一，同時(shí)ADSCs的分泌功能被認(rèn)為是發(fā)揮治療作用的主要功能基礎(chǔ)，而干細(xì)胞治療復(fù)雜性肛瘺尚處于研究發(fā)展階段，ADSCs治療復(fù)雜性肛瘺的具體作用機(jī)制及成分尚不明確，有待于進(jìn)一步研究和探索。