嚴(yán)麗娟 周 軍 田 順 許 濤 趙 云

乳腺癌是威脅女性健康的最常見的惡性腫瘤之一，乳腺癌病死率高的主要原因是乳腺癌轉(zhuǎn)移，最常見的轉(zhuǎn)移方式是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[1]。為了進(jìn)一步研究該疾病，建立合適的動(dòng)物模型十分必要。本研究建立新西蘭大白兔乳腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)模型，采用二維超聲、彩色多普勒超聲、彈性成像及超聲造影觀察瘤體及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)生長特征，評估該造模方法應(yīng)用于相關(guān)研究的可行性。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：普通級新西蘭大白兔20只，8月齡，其中雄性5只，雌性15只，體質(zhì)量為2.5～3.0kg， 均購自湖北逸摯誠生物科技有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(鄂)2021-0020。

2.實(shí)驗(yàn)材料與儀器：VX2腫瘤組織(重慶博培生物技術(shù)有限公司)，聲諾維(意大利Bracco公司)。Mindray Resona7S超聲診斷儀(中國深圳Mindray公司)，L14-5WU線陣探頭，頻率(5～14)MHz。水浴鍋(常州澳華公司)。正置白光拍照顯微鏡(日本Nikon公司)，型號(hào)Eclipse Ci-L。

3.模型建立：取-80℃冰箱保存的腫瘤組織，快速在37℃水浴鍋解凍，離心去除凍存液，在超凈工作臺(tái)中，用外科剪將VX2腫瘤組織剪碎為1～2mm3體積大小，冰上保存?zhèn)溆?。首先建立荷瘤兔。用固定器將雄性兔仰臥位固定，10%水合氯醛2ml/kg通過耳緣靜脈緩慢注射進(jìn)行麻醉。待角膜反射減弱、肌肉松弛或呼吸減慢即可進(jìn)行下述操作。采用切開植入法將腫瘤組織種植于兔的左下肢，穿刺針植入法將腫瘤組織種植于同一只兔的右下肢，比較兩種方法的種植效果。切開植入法：用無菌手術(shù)刀于5只雄兔左下肢肌肉豐富處(已備皮)切開約1cm開口，將剪碎的VX2腫瘤組織移入切口內(nèi)，逐層縫合，碘伏消毒，敷貼遮蔽切口。穿刺針植入法：將瘤粒置于18G穿刺針針頭頭端處，穿刺進(jìn)入上述5只雄兔右下肢肌肉豐富處(已備皮)，用內(nèi)芯將瘤粒頂出，緩慢拔出穿刺針，消毒，敷貼遮蔽。約3周后在植入部位見包塊凸出，荷瘤兔即制備成功。約3周后無菌條件下將瘤組織取出，制備兔乳腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)模型。用慶大霉素和0.9%NaCl注射液混合液清洗瘤體。在另一培養(yǎng)皿中用眼科剪將瘤塊裁剪成1～2mm3備用，所有操作于冰上進(jìn)行。麻醉(10%水合氯醛2ml/kg)后將實(shí)驗(yàn)雌兔仰臥位固定，剃毛，按外科無菌程序消毒術(shù)區(qū)皮膚，鋪巾。左側(cè)胸壁第3乳頭外上象限處切開長度約1cm切口，鈍性分離筋膜暴露乳墊，取1塊備用的腫瘤組織植入切口底部?？p合后當(dāng)天切口處撒青霉素，術(shù)后3天每天肌內(nèi)注射青霉素預(yù)防感染。每周觀察腫瘤的生長情況，并記錄腫瘤最大直徑，直至直接觸診到淋巴結(jié)或超聲觀察到約1cm異常淋巴結(jié)。

4.超聲檢查：采用Mindray Resona7S超聲診斷儀，L14-5WU線陣探頭，頻率(5～14)MHz。檢查前先對觀察區(qū)剃毛，10%水合氯醛2ml/kg通過耳緣靜脈緩慢注射進(jìn)行麻醉，兔仰臥位固定，充分暴露待觀察區(qū)。先二維多切面掃查瘤體，觀察其大小、形態(tài)、邊界、內(nèi)部回聲，再進(jìn)行彩色多普勒檢查，觀察其血流動(dòng)力學(xué)特征。觀察轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)時(shí)，先觸診找到顆粒狀淋巴結(jié)大致位置，再多切面掃查，除觀察上述特征之外，還需觀察其淋巴門結(jié)構(gòu)。之后點(diǎn)擊彈性成像模式，使取樣框盡量覆蓋腫瘤及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)，腫瘤較大探頭難以完全覆蓋時(shí)，多方位成像，固定而不加壓，持續(xù)至少5s，待圖像穩(wěn)定能清晰時(shí)存圖，重復(fù)3次。最后給予超聲造影檢查，將5ml 0.9%氯化鈉注射液加入造影劑聲諾維中制成混液，確定病灶部位，取最大切面，固定探頭，耳緣靜脈注射混液3ml，進(jìn)行實(shí)時(shí)造影檢查，觀察增強(qiáng)模式及強(qiáng)度。

5.病理學(xué)觀察：靜脈注射空氣處死實(shí)驗(yàn)兔后，取腫瘤及淋巴結(jié)，4%多聚甲醛固定、脫水、石蠟包埋、組織切片、HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察其組織形態(tài)。

結(jié) 果

1.模型生長情況：荷瘤兔腫瘤生長情況：本實(shí)驗(yàn)中采用了切開植入法和穿刺針植入法建立荷瘤兔，結(jié)果發(fā)現(xiàn)約3周后切開植入法腫瘤接種成功率為100%(5/5)，穿刺針植入法接種成功率為60%(3/5)，后者相同時(shí)間內(nèi)瘤體較前者小。乳腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)模型生長情況：移植后1～2周即可于左側(cè)胸壁第3乳頭處觸及腫瘤組織塊，活動(dòng)度差，類圓形，約2周內(nèi)增長速度較慢，3～4周增長速度明顯加快，成瘤率為93.3%(14/15)，瘤體大體觀見圖1A。約6周實(shí)驗(yàn)兔觸及淋巴結(jié)，經(jīng)過組織病理學(xué)檢查，證實(shí)9只實(shí)驗(yàn)兔淋巴結(jié)為轉(zhuǎn)移性，轉(zhuǎn)移率為64.3%(9/14)，轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)大體觀見圖2A。

2.超聲表現(xiàn)：腫瘤超聲表現(xiàn)：左側(cè)胸壁第 3 乳頭處可探及類圓形低回聲結(jié)節(jié)，邊界尚清，內(nèi)回聲不均，彩色多普勒血流顯像示腫瘤周邊可見較豐富彩流信號(hào)(圖1B)。彈性成像示腫瘤整體較軟，若中央出現(xiàn)壞死，壞死附近較硬(圖1C)。超聲造影示腫瘤呈向心性不均勻增強(qiáng)，部分可見充盈缺損(圖1D)。轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)超聲表現(xiàn)：轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)呈類圓形或橢圓形低回聲，淋巴門結(jié)構(gòu)消失或移位，彩色多普勒血流顯像示周邊可見點(diǎn)棒狀彩流信號(hào)(圖2B)。彈性成像示淋巴結(jié)較軟(圖2C)。超聲造影示整體呈不均勻增強(qiáng)，部分可見充盈缺損(圖2D)。

3.組織病理學(xué)結(jié)果：移植瘤呈類圓形，血供較豐富，切開后顯示腫瘤呈白色“魚肉樣”，質(zhì)地較軟，部分可見液化壞死。HE染色可見腫瘤細(xì)胞體積增大，胞質(zhì)豐富，淡紅染色，核膜不規(guī)則，核異型性明顯，核大深染，核質(zhì)比明顯增大，核仁可見，核分裂象多見(圖1E)。轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)見大量癌細(xì)胞巢，癌細(xì)胞體積大，核大深染，淋巴結(jié)的正常結(jié)構(gòu)被破壞(圖2E)。

圖2 轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)表現(xiàn)

討 論

乳腺癌是目前威脅女性健康最常見的惡性腫瘤，且有趨于年輕化的趨勢，一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移，預(yù)后明顯變差[2]。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是最常見的轉(zhuǎn)移途徑，因此腋窩淋巴結(jié)狀態(tài)及其治療十分重要。有關(guān)乳腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)部分實(shí)驗(yàn)不適合在人體內(nèi)進(jìn)行研究，因此相關(guān)動(dòng)物模型的建立是乳腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)研究的重要內(nèi)容，可靠的評價(jià)方法也具有重要意義。

VX2 腫瘤細(xì)胞株起源于 shope 病毒誘發(fā)的兔乳頭狀瘤衍生的鱗癌，它的高存活率使它們成為體內(nèi)接種的合適候選者[3]。該模型已用于子宮、舌頭、胃、下咽、乳房、直腸、肌肉、面頰、肝臟和肺在內(nèi)的各種部位兔腫瘤模型的建立，極易淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[4]。移植性乳腺癌模型是應(yīng)用最廣的，移植方法包括細(xì)胞懸液注射法，組織塊懸液接種法以及腫瘤組織塊接種法，國內(nèi)外研究證實(shí)，組織塊接種法易發(fā)生淋巴結(jié)及多器官的轉(zhuǎn)移，可能的原因是組織塊小，瘤細(xì)胞能獲得充分的營養(yǎng)和氧氣供應(yīng)，腫瘤細(xì)胞的濃度可以抵抗免疫屏障，延緩清除過程，保證腫瘤細(xì)胞的正常生長[5]。本研究利用腫瘤組織塊接種法建立乳腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)模型，因VX2腫瘤組織極易在肌層生長，所以利用少量腫瘤組織在荷瘤兔大腿肌層生長出大量腫瘤組織后再進(jìn)行后續(xù)研究[6]。針對組織塊接種法建立荷瘤兔，部分研究采用切口植入法，部分研究利用18G穿刺針將瘤粒植入特定部位[5,7]。本研究比較了上述兩種方法，發(fā)現(xiàn)前者成瘤率更高，腫瘤生長得更快、更大，更適合用于建立實(shí)驗(yàn)兔，可能的原因是切口植入法可以肉眼準(zhǔn)確地觀察到瘤體是否種植于特定部位，且瘤體生長空間較穿刺針植入法更大。

超聲具有實(shí)時(shí)簡便、安全無創(chuàng)的優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于乳腺癌及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的診斷。隨著各種超聲新技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，超聲檢查在乳腺癌及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的診斷中扮演著越來越重要的角色[8]。二維超聲可以觀察移植瘤和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)邊界、形態(tài)、直徑、內(nèi)部回聲、有無壞死及淋巴結(jié)淋巴門有無受侵犯等，彩色多普勒可以反映移植瘤及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)血流豐富程度及分布特征。人乳腺癌超聲多表現(xiàn)為不均勻低回聲結(jié)節(jié)，形態(tài)不規(guī)則，邊界不清，轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)淋巴門結(jié)構(gòu)不清，彩流集中在周邊。本研究實(shí)驗(yàn)兔瘤體隨著時(shí)間的延長體積逐漸增大，表現(xiàn)為低回聲結(jié)節(jié)，邊界尚清，內(nèi)部回聲從不均勻到出現(xiàn)液化壞死，彩流開始稀疏而后逐漸增多，轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)隨時(shí)間延長逐漸增大，淋巴門結(jié)構(gòu)不清，部分伴液化壞死，彩流分布于周邊。該模型乳腺癌、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)二維及彩色多普勒超聲表現(xiàn)與人類似。

超聲彈性成像是一種對組織硬度敏感的成像技術(shù)，利用特定病理或生理過程引起的軟組織彈性變化，使組織硬度的定量評估成為可能[9]。根據(jù)彈性模式圖彩色編碼分為3型：1型為藍(lán)色或藍(lán)綠色(硬度較大)，2型為綠色或黃綠色(中等硬度)，3型為紅色或橙紅色(硬度較小)[10]。人乳腺癌及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)彈性成像均提示較硬，本模型乳腺癌及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)彈性成像均提示較軟，該特征與人乳腺癌及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)存在差異的原因可能與VX2腫瘤本身質(zhì)地較軟的特征相關(guān)[11]。超聲造影是一種使用微泡造影劑提供組織血流實(shí)時(shí)信息的安全且容易獲得的技術(shù)[12]。氣泡極大地影響超聲后向散射，增加血管對比度，進(jìn)而明顯提高超聲診斷的分辨力、敏感度和特異性[13]。人乳腺癌及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)超聲造影均表現(xiàn)為向心性不均勻增強(qiáng)，部分可見灌注缺損，本模型乳腺癌及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)超聲造影表現(xiàn)與人一致[11]。

本研究采用組織包埋法制備兔乳腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)模型，雖然部分超聲特征與人存在差異，但該模型仍存在如下優(yōu)點(diǎn)：①成瘤率為93.3%，轉(zhuǎn)移率為64.3%，成瘤率高，較易轉(zhuǎn)移；②兔的組織病理學(xué)特征與人類相似，在兔身上的研究可以更好地?cái)U(kuò)展到人類[5];③瘤體及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)較表淺，易于各種超聲技術(shù)觀察;④較易飼養(yǎng)，存活率及存活時(shí)間較長，便于實(shí)驗(yàn)觀察。

本實(shí)驗(yàn)利用切開植入法成功建立乳腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)模型，常見超聲技術(shù)能便捷地探查移植瘤及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的生長特征及變化過程，可用于乳腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)各種實(shí)驗(yàn)研究。