李向南 沈 薦 李敏哲 王振軍

在全球范圍內(nèi)，結(jié)直腸癌發(fā)生率在所有惡性腫瘤中排名第2位，病死率排名第3位[1]。結(jié)直腸癌患者5年生存率為64%，但晚期結(jié)直腸癌患者5年生存率僅為12%[2]。靶向治療為降低晚期結(jié)直腸癌患者病死率帶來了希望，然而耐藥等問題導(dǎo)致生存獲益并不十分理想[3]。因此，有必要進(jìn)一步拓展新的結(jié)直腸癌治療靶點(diǎn)。近年來，環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)與腫瘤的關(guān)系成為研究熱點(diǎn)。circRNA是一種通過反向剪接形成的特殊環(huán)狀結(jié)構(gòu)RNA[4]。circRNA在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、代謝以及免疫等多方面發(fā)揮重要作用，有望成為新的治療靶點(diǎn)[5～8]。筆者前期對(duì)circRNA與結(jié)直腸癌的關(guān)系進(jìn)行了探索[9～12]。其中，筆者通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的circRNA，即circPRKAG2。circPRKAG2近年來已被circBase數(shù)據(jù)庫收錄(circBase ID: hsa_circ_0142408)[9,13,14]。筆者測(cè)序結(jié)果顯示，circPRKAG2在結(jié)直腸癌組織中顯著下調(diào)，差異倍數(shù)(fold change，F(xiàn)C)為0.002。然而，circPRKAG2的功能尚不清楚。因此，本研究旨在分析circPRKAG2在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及其對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞惡性表型的影響。

材料與方法

1.標(biāo)本收集：收集2016年9月～2019年7月在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院接受手術(shù)治療的68例結(jié)直腸癌患者標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：①均為原發(fā)性結(jié)直腸癌患者；②術(shù)前未接受放療、化療及其他新輔助治療；③臨床及病理資料完整。標(biāo)本包括癌組織和癌旁非腫瘤組織。標(biāo)本離體經(jīng)液氮速凍后存儲(chǔ)于-80℃冰箱。本研究通過首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)審批(倫理審批號(hào)：2021-科-127)。

2.細(xì)胞培養(yǎng)：人結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW480和HCT116購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(American type culture collection，ATCC)。細(xì)胞培養(yǎng)方法：基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)+100U/ml青霉素以及100μg/ml鏈霉素。對(duì)于SW480細(xì)胞，基礎(chǔ)培養(yǎng)基采用DMEM；對(duì)于HCT116細(xì)胞，基礎(chǔ)培養(yǎng)基采用McCoy′s 5A?；A(chǔ)培養(yǎng)基、FBS、青霉素和鏈霉素均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。

3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)：利用 Trizol(美國(guó)Invitrogen公司)試劑提取RNA。反轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司。引物序列如下：circPRKAG2上游引物：5′-CGGGGGCATCAGGTTTTTCT-3′，下游引物：5′-GGCTGTCCACCTTTCGAGA-3′；PRKAG2 mRNA上游引物：5′-CTTGGGCACAGGCATAGGAG-3′，下游引物：5′-CATTTTCCACCCTCTCGGCT-3′；內(nèi)參基因18S rRNA上游引物：5′-AAACGGCTACCACATCCA-3′，下游引物：5′-CACCAGACTTGCCCCTCCA-3′。熒光定量PCR的結(jié)果使用2-ΔΔCt法分析。

4.siRNA轉(zhuǎn)染：針對(duì)circPRKAG2反向剪接位點(diǎn)設(shè)計(jì)兩條小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)。siRNA及陰性對(duì)照(si-NC)由上海吉瑪制藥有限公司合成。序列如下：si-#1：5′-CCCGCTCCAGAAAAAGACC-3′；si-#2：5′-GCTCCAGAAAAAGACCTGA-3′；si-NC：5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

5.細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物公司。結(jié)直腸癌細(xì)胞以每孔1.0×103個(gè)接種于96孔板，每孔設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。分別在細(xì)胞培養(yǎng)0、1、2、3和4天后加入CCK-8試劑10微升/孔。孵育2h后，利用酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm處吸光度(A)值。計(jì)算5孔平均A值，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，A值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

6.克隆形成實(shí)驗(yàn)：結(jié)直腸癌細(xì)胞以每孔5.0×102個(gè)接種于6孔板，每孔設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2周。棄去培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色。洗去殘余染色液，對(duì)6孔板拍照并統(tǒng)計(jì)細(xì)胞克隆數(shù)量。

7.細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)：使用Transwell小室(無錫NEST公司)進(jìn)行細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)。侵襲實(shí)驗(yàn)中使用的Matrigel購(gòu)自美國(guó)Corning公司。接種約10×104個(gè)結(jié)直腸癌細(xì)胞至上室，細(xì)胞懸液體積為200μl。下室為700μl含有20% FBS的完全培養(yǎng)基。48h后吸除培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色。用濕棉簽輕輕拭去小室基膜上層細(xì)胞。使用倒置顯微鏡以100倍拍攝，觀察并計(jì)算5個(gè)隨機(jī)視野的遷移或侵襲細(xì)胞數(shù)。

8.分組：根據(jù)circ PRKAG2相對(duì)表達(dá)量的中位數(shù)作為界值，將68例結(jié)直腸癌組織分為低表達(dá)組和高表達(dá)組，低表達(dá)組為34例，高表達(dá)組為34例；細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組為si-#1和si-#2組，對(duì)照組為si-NC組。

9.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：使用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。使用GraphPad Prism 7.0軟件繪圖。癌及癌旁非腫瘤組織之間circPRKAG2表達(dá)水平的比較采用Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)；兩組細(xì)胞各指標(biāo)的比較采用t檢驗(yàn)；不同臨床病理特征間circPRKAG2表達(dá)水平的比較采用χ2檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.circPRKAG2在結(jié)直腸癌組織中呈現(xiàn)低表達(dá)：qRT-PCR結(jié)果顯示，與癌旁非腫瘤組織比較，結(jié)直腸癌組織中circPRKAG2表達(dá)水平顯著下降(P<0.001)。Sanger測(cè)序證實(shí)circPRKAG2的反向剪接位點(diǎn)(圖1)。

圖1 circPRKAG2在結(jié)直腸癌組織中顯著下調(diào)

2.circPRKAG2表達(dá)水平與結(jié)直腸癌不良臨床病理特征呈負(fù)相關(guān)：qRT-PCR結(jié)果顯示，81%的癌組織(55/68)表現(xiàn)為circPRKAG2下調(diào)。利用circPRKAG2相對(duì)表達(dá)量的中位數(shù)作為界值，筆者將68例結(jié)直腸癌患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組(圖2)。利用χ2檢驗(yàn)分析circPRKAG2表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系。結(jié)果表明，circPRKAG2表達(dá)水平與患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑以及分化程度均無明顯相關(guān)性(P>0.05)，但與腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及TNM分期均呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05，表1)。

圖2 circPRKAG2在68對(duì)結(jié)直腸癌組織中的具體表達(dá)情況

表1 circPRKAG2表達(dá)水平與結(jié)直腸癌臨床病理特征之間的關(guān)系[n(%)]

3.利用siRNA干擾結(jié)直腸癌細(xì)胞中circPRKAG2的表達(dá)：向結(jié)直腸癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染siRNA后，提取RNA，行qRT-PCR驗(yàn)證。結(jié)果表明，兩條siRNA中，si-#2的敲除效率更高，其在兩個(gè)細(xì)胞系中干擾效率均>80%(P<0.001)。另外，si-#2對(duì)circPRKAG2宿主基因來源的PRKAG2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量無影響(圖3)。因此，筆者利用si-#2轉(zhuǎn)染細(xì)胞并進(jìn)行體外細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)。

圖3 siRNA干擾結(jié)直腸癌細(xì)胞中circPRKAG2的表達(dá)

4.干擾circPRKAG2能夠促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞克隆形成能力：對(duì)si-NC組和si-#2組結(jié)直腸癌細(xì)胞進(jìn)行克隆形成實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，si-#2組細(xì)胞克隆數(shù)量顯著多于si-NC組(P<0.001，圖4)

圖4 干擾circPRKAG2促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞克隆形成能力(結(jié)晶紫染色)

5.干擾circPRKAG2能夠促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖能力：對(duì)si-NC組和si-#2組結(jié)直腸癌細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明干擾circPRKAG2后結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖能力顯著升高(P<0.001，圖5)。

圖5 干擾circPRKAG2促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖能力

6.干擾circPRKAG2能夠促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移能力：對(duì)si-NC組和si-#2組結(jié)直腸癌細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明si-#2組遷移至小室基膜下層的細(xì)胞數(shù)顯著高于si-NC組(P<0.05，圖6)。

圖6 干擾circPRKAG2促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移能力(結(jié)晶紫染色)

7.干擾circPRKAG2能夠促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲能力：對(duì)si-NC組和si-#2組結(jié)直腸癌細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明si-#2組侵襲至小室基膜下層的細(xì)胞數(shù)顯著高于si-NC組(P<0.01，圖7)。

圖7 干擾circPRKAG2促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲能力(結(jié)晶紫染色)

討 論

circRNA于1979年在植物病毒中首次被發(fā)現(xiàn)[15]。circRNA最初被認(rèn)為是剪接錯(cuò)誤產(chǎn)生的低豐度、無意義RNA[4]。近年來，隨著高通量測(cè)序和生物信息學(xué)的發(fā)展，circRNA被發(fā)現(xiàn)廣泛表達(dá)于各類細(xì)胞和組織，并在多種惡性腫瘤中存在表達(dá)調(diào)控異常[16～18]。研究表明，circRNA能通過多種機(jī)制影響腫瘤細(xì)胞惡性表型。例如，circSDHC作為miR-127-3p的分子海綿，通過上調(diào)周期蛋白依賴性激酶抑制因子3/E2F轉(zhuǎn)錄因子1信號(hào)通路促進(jìn)腎癌增殖和轉(zhuǎn)移[19]。circPCNX通過結(jié)合AU結(jié)合因子1，阻斷后者進(jìn)一步結(jié)合p21 mRNA，促進(jìn)p21 mRNA穩(wěn)定化和蛋白表達(dá)，進(jìn)而抑制宮頸癌細(xì)胞增殖[20]。此外，研究表明circRNA能穩(wěn)定表達(dá)于血漿、血清、外泌體和尿液等多種體液，有望成為新的腫瘤診斷標(biāo)志物[21]。

筆者前期利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)了一系列在結(jié)直腸癌組織中差異表達(dá)的circRNA[9]。通過進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，其中多種circRNA在結(jié)直腸癌進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[10～12]。例如circDDX17在結(jié)直腸癌中發(fā)揮抑癌分子作用[9]；circVAPA通過吸附miR-101促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞惡性表型[10]；circHUWE1通過吸附miR-486促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[11]；circRUNX1通過miR-145-5p/IGF1信號(hào)通路促進(jìn)結(jié)直腸癌進(jìn)展[12]。

筆者的測(cè)序結(jié)果顯示，在所有結(jié)直腸癌差異表達(dá)的circRNA中，circPRKAG2表達(dá)量最低，其FC值僅為0.002，P=2.52×10-6。circPRKAG2的功能尚未見報(bào)道。本研究利用qRT-PCR在68對(duì)結(jié)直腸癌和癌旁非瘤組織中驗(yàn)證circPRKAG2的表達(dá)。結(jié)果表明，circPRKAG2在結(jié)直腸癌組織中顯著下調(diào)。另外，circPRKAG2的表達(dá)水平與腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及TNM分期等不良臨床病理特征呈負(fù)相關(guān)。體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，干擾circPRKAG2顯著促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞克隆形成、增殖、遷移和侵襲能力，提示circPRKAG2在結(jié)直腸癌中可能發(fā)揮抑癌分子作用。

circPRKAG2的宿主基因?yàn)橄佘?磷酸激活的蛋白激酶γ2調(diào)節(jié)亞單位基因(protein kinase AMP-activated non-catalytic subunit gamma 2，PRKAG2)。PRKAG2與惡性腫瘤關(guān)系密切[22～24]。研究表明，PRKAG2基因存在多種單核苷酸多態(tài)性，例如rs7789674、rs6964824等。這些基因變異與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[22]。在肝癌中PRKAG2可增強(qiáng)化療藥物敏感度，并可作為肝癌預(yù)后預(yù)測(cè)的生物學(xué)標(biāo)志物[23]。PRKAG2來源的長(zhǎng)鏈非編碼RNA PRKAG2-AS1在結(jié)直腸癌、前列腺癌和食管癌中表達(dá)上調(diào)，且促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性表型[24]。由此可見，PRKAG2除了本身作為一種重要的腫瘤相關(guān)基因，還能生成多種類型非編碼RNA來調(diào)控腫瘤進(jìn)展。

綜上所述，本研究初步證實(shí)circPRKAG2在結(jié)直腸癌中發(fā)揮抑癌分子作用。circPRKAG2在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)下調(diào)。circPRKAG2的表達(dá)水平與腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及TNM分期呈負(fù)相關(guān)。circPRKAG2體外抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞惡性表型。因此，circPRKAG2可能在結(jié)直腸癌中發(fā)揮抑癌分子作用，其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。