張宗祥 方迪龍

動脈粥樣硬化是一種嚴重的心血管疾病[1]。動脈粥樣硬化斑塊形成過程由循環(huán)單核細胞進入血管壁轉(zhuǎn)為巨噬細胞并吞噬氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，oxLDL)形成泡沫細胞，粥樣斑塊形成標志是泡沫細胞[2]。因此，有效降低巨噬細胞來源泡沫細胞的形成比例是防治動脈粥樣硬化的重要策略。

大麻素Ⅱ型受體(cannabinoid receptor 2，CB2R)存在巨噬細胞等炎性免疫細胞中[3]。已有報道指出,激動CB2R在動脈粥樣硬化中具有機體保護作用，但是其具體的作用機制仍尚未明確[4]。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3，NLRP3)、凋亡相關(guān)speck樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC)和蛋白酶caspase-1齊聚形成炎性小體并將休眠的pro-caspase-1轉(zhuǎn)化為活性caspase-1，NLRP3炎性小體與炎癥及免疫等疾病密切相關(guān)[5]。動脈粥樣硬化患者的NLRP3炎性小體會引發(fā)粥樣斑塊的形成和發(fā)展[6]。近年來研究顯示，CB2R激活可以通過抑制巨噬細胞中NLRP3炎性小體來改善結(jié)腸炎[7～9]。然而，CB2R在動脈粥樣硬化中尚未有相關(guān)報道，研究CB2R在動脈粥樣硬化中發(fā)揮的作用及其分子機制具有積極意義。

因此，本研究擬通過研究CB2R對oxLDL處理THP-1巨噬細胞形成泡沫細胞及NLRP3炎性小體的影響，來驗證CB2R是否通過調(diào)控NLRP3炎性小體的產(chǎn)生抗動脈粥樣硬化。本研究探究了CB2R在動脈粥樣硬化中的作用和機制，為動脈粥樣硬化患者提供新的治療策略。

材料與方法

1.材料：THP-1細胞來源于中國科學(xué)院上海細胞庫；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清和青霉素-鏈霉素購自美國Thermo Fisher Scientific公司；單克隆抗體NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1、p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR、p-P70S6K、P70S6K、GAPDH和抗兔IgG購自美國Cell Signaling Technology公司；oxLDL、佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)、PBS緩沖液、異丙醇、多聚甲醛、油紅O染色液、總膽固醇試劑盒、游離膽固醇試劑盒和RIPA裂解液購自北京Solarbio公司；白介素-1β(IL-1β)和白介素-18(IL-18)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒購自美國Invitrogen公司。

2.細胞培養(yǎng):THP-1細胞在37℃、5% CO2的RPMI 1640培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素)培養(yǎng)；THP-1細胞用PMA處理分化為THP-1巨噬細胞。

3.細胞分組：對照組：正常培養(yǎng)的THP-1巨噬細胞；oxLDL組：通過oxLDL誘導(dǎo)的THP-1巨噬細胞；oxLDL+JWH-015組：oxLDL誘導(dǎo)的THP-1巨噬細胞通過CB2R激動劑JWH-015進行處理；oxLDL+JWH-015+NSS組：通過NLPR3炎性小體激動劑尼日利亞菌素鈉鹽(NSS)進一步處理oxLDL+JWH-015組的THP-1巨噬細胞。

4.油紅O染色檢測:接下來將2×105個/孔THP-1細胞接種于6孔板中，依次用PMA和oxLDL處理。72h后，PBS緩沖液漂洗2次，4%多聚甲醛固定25min。用60%異丙醇沖洗THP-1巨噬細胞15s，37℃油紅O染色液孵育30min。最后，用PBS緩沖液沖洗THP-1巨噬細胞并在顯微鏡下拍照。

5.總膽固醇和膽固醇酯測定：利用總膽固醇和游離膽固醇試劑盒測定各組細胞中的膽固醇含量，總膽固醇和游離膽固醇的差值為膽固醇酯含量。膽固醇酯與總膽固醇比值超過50%的細胞認為已轉(zhuǎn)化為泡沫細胞。

6.Western blot法檢測：收集各組THP-1巨噬細胞用RIPA裂解液進行裂解，經(jīng)電泳后將待測樣品移到PDVF膜上。將5%脫脂乳室溫封閉1.5h后，與用一抗(1∶1000，美國CST公司)包括NLRP3(貨號#15101)、ASC, 1∶1000, pro-caspase-1(貨號#24232)、caspase-1(貨號#2225)、p-AMPK(貨號#4184)、AMPK(貨號#2532)、p-mTOR(貨號#2971)、mTOR(貨號#2972)、p-P70S6K(貨號#9204)、P70S6K(貨號#9202)和GAPDH(貨號#2118)在4℃下反應(yīng)過夜，經(jīng)清洗后用二抗HRP標記抗兔IgG(1∶2000, 貨號#7074)室溫反應(yīng)1.5h，最后使用ECL進行條帶顯色。

7.ELISA檢測:利用ELISA試劑盒使用方法來測量THP-1巨噬細胞的IL-1β和IL-18表達情況。

8.統(tǒng)計學(xué)方法：使用GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，兩組間數(shù)據(jù)比較用t檢驗，多組間數(shù)據(jù)比較用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.oxLDL誘導(dǎo)THP-1巨噬細胞的泡沫細胞形成、NLRP3炎性小體激活：首先PMA處理后THP-1細胞分化為巨噬細胞，并通過oxLDL誘導(dǎo)THP-1巨噬細胞形成泡沫細胞。油紅O染色檢測結(jié)果如圖1A所示，oxLDL孵育24h后，THP-1巨噬細胞中積累了大量脂滴。此外，細胞質(zhì)膽固醇酯含量超過總膽固醇的50%(表1，P<0.05)。上述結(jié)果驗證了oxLDL對THP-1巨噬細胞形成泡沫細胞的誘導(dǎo)作用。接著，Western blot法和ELISA檢測結(jié)果顯示，oxLDL誘導(dǎo)對THP-1巨噬細胞中NLPR3炎性小體相關(guān)蛋白表達的影響。與對照組比較，oxLDL誘導(dǎo)顯著提高了THP-1巨噬細胞中NLRP3、ASC、caspase-1的表達水平(圖1B)。此外，oxLDL處理的THP-1巨噬細胞上清液中IL-1β和IL-18的濃度也顯著升高(圖1C)。以上結(jié)果揭示了oxLDL能夠誘導(dǎo)THP-1巨噬細胞的泡沫細胞形成，同時ox-LDL通過促進NLRP3、IL-1β和IL-18的表達來激活NLPR3炎性小體。

圖1 oxLDL誘導(dǎo)THP-1巨噬細胞形成泡沫細胞并激活NLRP3炎性小體

表1 oxLDL對各組THP-1巨噬細胞膽固醇含量的影響

2.CB2R抑制oxLDL誘導(dǎo)THP-1巨噬細胞的泡沫細胞形成：為了驗證CB2R對oxLDL誘導(dǎo)的THP-1巨噬細胞的作用，通過CB2R激動劑JWH-015處理THP-1巨噬細胞。油紅O染色結(jié)果顯示，JWH-015能夠顯著抑制由oxLDL誘導(dǎo)的泡沫細胞形成(圖2)，并且細胞質(zhì)膽固醇酯含量也顯著下降(表2，P<0.05)。已知降低巨噬的泡沫細胞形成能夠防治動脈粥樣，而CB2R能夠減弱THP-1巨噬細胞形成泡沫細胞[2]。此結(jié)果表明CB2R發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用，其作用機制可能通過抑制oxLDL誘導(dǎo)THP-1巨噬細胞的泡沫細胞形成來實現(xiàn)。

圖2 CB2R抑制oxLDL誘導(dǎo)THP-1巨噬細胞的泡沫細胞形成(油紅O染色，×100)

表2 CB2R對各組THP-1巨噬細胞膽固醇含量的影響

3.CB2R抑制oxLDL誘導(dǎo)的THP-1巨噬細胞中的NLPR3炎性小體:同樣，進一步研究CB2R對NLPR3炎性小體的影響。本實驗通過Western blot法和ELISA檢測CB2R對oxLDL誘導(dǎo)的THP-1巨噬細胞中NLPR3炎性小體的相關(guān)蛋白表達。結(jié)果顯示，CB2R激動劑JWH-015能夠顯著抑制由oxLDL誘導(dǎo)的NLRP3相關(guān)蛋白的表達水平(圖3A)。同時ELISA結(jié)果也顯示，THP-1巨噬細胞上清液中由oxLDL誘導(dǎo)升高的IL-1β和IL-18表達也被JWH-015顯著抑制(圖3B)。這些結(jié)果表明，CB2R可以減弱oxLDL誘導(dǎo)THP-1巨噬細胞的泡沫細胞形成，同時也對激活的NLRP3炎性小體產(chǎn)生抑制作用。

圖3 CB2R抑制oxLDL誘導(dǎo)的THP-1巨噬細胞中的NLPR3炎性小體

4.CB2R通過調(diào)節(jié)NLPR3炎性小體抑制形成泡沫細胞:上述結(jié)論證明了CB2R對oxLDL誘導(dǎo)THP-1巨噬細胞的NLRP3炎性小體具有顯著抑制的作用，因此，推測CB2R可能通過NLPR3炎性小體來抑制THP-1巨噬細胞的泡沫細胞形成。本研究在CB2R激動劑JWH-015處理的基礎(chǔ)上進一步進行實驗驗證，通過NLPR3炎性小體激動劑尼日利亞菌素鈉鹽(nigericin sodium salt，NSS)處理細胞從而激活NLPR3炎性小體(圖4中A、B)。油紅O染色結(jié)果(圖4C)和細胞質(zhì)膽固醇酯含量的檢測(表3，P<0.05)均顯示，由JWH-015抑制的泡沫細胞形成會被NSS逆轉(zhuǎn)。此結(jié)果表明CB2R能夠通過調(diào)節(jié)NLPR3炎性小體來抑制泡沫細胞形成。

圖4 CB2R通過調(diào)節(jié)NLPR3炎性小體抑制泡沫細胞形成

表3 各組THP-1巨噬細胞中膽固醇含量的變化

5.CB2R通過AMPK-mTOR-p70S6K通路調(diào)節(jié)NLPR3炎性小體:本研究通過CB2R激動劑JWH-015和AMPK拮抗劑compound C處理THP-1巨噬細胞，Western blot法檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，JWH-015能夠增加p-AMPK的表達水平、抑制p-mTOR和p-p70S6K的表達水平，而這個結(jié)果又會被compound C逆轉(zhuǎn)(圖5A)。另外，對NLRP3炎性小體相關(guān)蛋白的Western blot法檢測發(fā)現(xiàn)，compound C會顯著促進NLRP3炎性小體相關(guān)蛋白的表達水平(圖5B)。以上結(jié)果證實了CB2R能夠通過AMPK-mTOR-p70S6K通路調(diào)節(jié)NLPR3炎性小體，抑制THP-1巨噬細胞泡沫細胞形成，進而發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用。

圖5 CB2R通過AMPK-mTOR-p70S6K通路調(diào)節(jié)NLPR3水平

討 論

動脈粥樣硬化是導(dǎo)致心肌梗死和腦卒中等心血管疾病發(fā)生的主要原因，同時動脈粥樣硬化的典型病理是形成含有大量壞死細胞和炎性細胞[10]。本文研究結(jié)果表明，CB2R抗動脈粥樣硬化具有良好效果，但具體機制尚未清楚。

巨噬細胞失調(diào)是動脈粥樣硬化的主要原因之一[11]。巨噬細胞通過產(chǎn)生脂肪性泡沫細胞和分泌炎性介質(zhì)在動脈粥樣硬化中發(fā)揮關(guān)鍵作用，通過oxLDL是引發(fā)動脈粥樣硬化病變的重要原因[12,13]。本文為了驗證這一結(jié)論，進行了一系列實驗發(fā)現(xiàn)oxLDL能夠誘導(dǎo)THP-1巨噬細胞形成泡沫細胞。動脈粥樣硬化發(fā)現(xiàn)IL-1β高表達，IL-1β通過激活內(nèi)皮細胞和巨噬細胞，推動動脈粥樣硬化的進展[14]。近年來研究表明，在動脈粥樣硬化中引起IL-1β升高的主要原因是NLPR3炎性小體激活[15]。本文進一步對NLPR3炎性小體的研究發(fā)現(xiàn)，ox-LDL不僅能誘導(dǎo)THP-1巨噬細胞形成泡沫細胞，還能通過提高NLRP3、IL-1β和IL-18的表達從而激活NLPR3炎性小體。

在正常生理條件下，CB2R在中樞和外周組織中低表達，而在炎癥刺激或組織損傷后表達升高[16]。并且有證據(jù)表明，激活CB2R在炎癥和自身免疫相關(guān)疾病中發(fā)揮保護作用[7]。本研究通過Western blot法和ELISA檢測發(fā)現(xiàn)CB2R能夠?qū)σ呀?jīng)激活的NLRP3炎性小體發(fā)揮抑制作用，這表明CB2R可能通過調(diào)節(jié)NLPR3炎性小體進而抑制泡沫細胞形成。對此，筆者通過NLPR3炎性小體激動劑NSS對THP-1巨噬細胞進行處理，油紅O染色結(jié)果證實了筆者的想法，CB2R能夠通過調(diào)節(jié)NLPR3炎性小體來抑制泡沫細胞形成。筆者進一步研究了CB2R調(diào)節(jié)NLPR3炎性小體的調(diào)控途徑，發(fā)現(xiàn)CB2R能夠抑制AMPK-mTOR-p70S6K通路的激活進而抑制NLPR3炎性小體。研究顯示AMPK-mTOR-p70S6K通路通過缺血后處理誘導(dǎo)保護性自噬來發(fā)揮在心肌損傷和糖尿病心肌病中的作用[17]。此外，研究表明CB2R可通過AMPK-mTOR-p70S6K通路改善化心肌梗死[18]。

綜上所述，前期研究表明CB2R表現(xiàn)出良好的抗動脈粥樣硬化效果，進一步研究發(fā)現(xiàn)，CB2R對oxLDL處理THP-1巨噬細胞形成泡沫細胞具有抑制效果，并且CB2R能夠抑制NLRP3炎性小體。進一步對CB2R的分子機制研究表明，CB2R能夠調(diào)控AMPK-mTOR-p70S6K通路而抑制NLPR3炎性小體。這些結(jié)果揭示了，CB2R抗動脈粥樣硬化的機制可能是通過調(diào)控AMPK-mTOR-p70S6K通路而抑制NLPR3炎性小體，進而抑制THP-1巨噬細胞形成泡沫細胞。調(diào)控CB2R表達可作為開發(fā)治療動脈粥樣硬化策略的新思路。