王玉文 周雅琪 宋宗義 趙永麗

甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)是甲狀腺惡性腫瘤中最常見的組織類型，其發(fā)生率在過去幾十年中一直在穩(wěn)步上升[1,2]。盡管大多數(shù)病例具有良好的預(yù)后和治療反應(yīng)，但高達(dá)30%的患者在10年內(nèi)出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[3]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一組具有18～25個序列，沒有編碼能力的單鏈RNA，可以通過與目標(biāo)mRNA的3′非翻譯區(qū)(untranslated region，UTR)結(jié)合，參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)[4]。miRNA調(diào)節(jié)細(xì)胞周期及多種基本生理過程，包括細(xì)胞凋亡、增殖、遷移、侵襲和分化，并且miRNA表達(dá)或功能在各種惡性腫瘤(包括PTC在內(nèi)的)中失調(diào)[5，6]。miR-204-5p通過靶向HMGB1抑制甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞增殖、侵襲和遷移[7]。最近的基因芯片的測序結(jié)果顯示miR-204-5p在PTC中下調(diào)[8]。然而，miR-204-5p在PTC中的生物學(xué)功能和潛在機(jī)制未知。

白細(xì)胞介素11(interleukin 11，IL-11)是一種屬于多功能IL-6細(xì)胞因子家族的造血細(xì)胞因子，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起重要作用[9,10]。IL-11的高表達(dá)對乳腺癌、胃癌和細(xì)胞性腎細(xì)胞癌等惡性腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲具有促進(jìn)作用[11～13]。本研究旨在探討miR-204-5p在PTC中抗癌角色和生物學(xué)功能。

材料與方法

1.主要試劑和儀器：DMEM培養(yǎng)基購自美國Thermo Scientific公司；psiCHECK-2熒光素酶載體購自美國Promega公司；miR-204-5p模擬物(miR-204-5p)、miR-204-5p陰性對照(miR-neg)、miR-204-5p抑制劑(anti-miR-204-5p)和抑制劑對照(anti-miR-neg)購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；Lipofectamine 3000購自美國Invitrogen公司；聚凝胺購自美國Sigma公司；miRNeasy Mini試劑盒購自德國Qiagen公司；SuperScript Ⅲ反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Invitrogen公司；ABI 7900HT熒光定量PCR儀購自美國Applied Biosystems公司；SYBR Premix Ex Taq Ⅱ購自中國大連TaKaRa公司；MTT試劑盒購自美國Invitrogen公司；IX81倒置顯微鏡購自日本Olympus公司；FACScan流式細(xì)胞儀購自美國BD Biosciences公司；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD Biosciences公司；雙熒光素酶報告系統(tǒng)購自美國Promega公司；BCA試劑盒購自北京索萊寶生物工程有限公司；白細(xì)胞介素11(interleukin 11，IL-11)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)購自英國Abcam公司；辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗兔IgG購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；ECL發(fā)光系統(tǒng)購自美國Amersham Biosciences公司。

2.細(xì)胞培養(yǎng):人PTC細(xì)胞系(TCP-1和BCPAP)、人甲狀腺正常細(xì)胞NTHY-ORI 3-1和HEK293T購自美國ATCC細(xì)胞庫，在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中于37℃和5% CO2中培養(yǎng)。

3.載體構(gòu)建:miR-204-5p、miR-neg、anti-miR-204-5p和anti-miR-neg從商業(yè)公司獲得，并通過測序驗證結(jié)果。根據(jù)說明書，Lipofectamine 3000用于轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染序列如下：miR-204-5p: 5′-UUCCCUUUGUCAUCCUAUGCCU-3′; anti-miR-204-5p: 5′-AGGCAUAGGAUGACAAAGGGAA-3′。

4.慢病毒轉(zhuǎn)染:將含有pre-miR-204-5p的450bp片段克隆到pWPXL載體中以生成pWPXL-miR-204。使用Lipofectamine 3000將pWPXL或pWPXL-miR-204-5p構(gòu)建體與所對應(yīng)的包裝質(zhì)粒psPAX2或pMD2G共轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中，48h后收集病毒顆粒。TPC-1細(xì)胞用含有8mg/ml聚凝胺的重組慢病毒轉(zhuǎn)染。通過qRT-PCR檢測穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染基因表達(dá)。

5.qRT-PCR:根據(jù)制造商的說明，使用miRNeasy Mini試劑盒提取總RNA和miRNA。SuperScript Ⅲ反轉(zhuǎn)錄試劑盒用于將RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA，并在ABI 7900HT熒光定量PCR儀上使用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ進(jìn)行qRT-PCR。將靶基因表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)化為內(nèi)部對照(U6或GAPDH)的水平，并由2-△△CT計算比較差異。引物序列如下：miR-204-5p 上游引物:5′-ACAATTGAACGTCCCTTTGCC-3′，下游引物:5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′；IL-11上游引物:5′-GGGAATTTGTCCCTCTGGCA-3′，下游引物:5′-CTGGGACTTAAGACCTCCAGC-3′；GAPDH 上游引物：:5′-GCAACTAGGATGGTGTGGCT-3′，下游引物:5′-TCCCATTCCCCAGCTCTCATA-3′；U6上游引物:5′-CTAGATAATGGTGCTGATAGATGGA-3′，下游引物:5′-CGGTATAGCTGGACGCTCTG-3′。

6.細(xì)胞增殖和平板克隆試驗：使用MTT法測定法評估細(xì)胞活力，具體參照文獻(xiàn)所述[14]。簡而言之，將2×103個細(xì)胞培養(yǎng)在96孔板中，并在24、48、72和96h用20ml MTT(0.5mg/ml)染色4h。棄上清液，每孔加入200ml DMSO溶解沉淀。在490nm處測量吸光度。對于平板克隆試驗，將細(xì)胞以2×102個/孔接種在6孔板中并生長2周。形成的菌落用PBS洗滌，甲醇固定，0.5%結(jié)晶紫染色。在IX81倒置顯微鏡下計數(shù)菌落數(shù)。

7.細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡分析：對于細(xì)胞周期分析，收集2×105個轉(zhuǎn)染細(xì)胞，用70%乙醇固定并在4℃下孵育過夜。洗滌后，細(xì)胞用RNase A(100mg/ml)處理30min，然后用PI(50mg/ml)在暗室中染色30min。使用FACScan流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期分布。使用Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒評估細(xì)胞凋亡。

8.雙熒光素酶報告基因分析：HEK293T細(xì)胞在96孔板中培養(yǎng)，并用50ng野生型(WT)或突變(MUT)IL-11 3′-UTR構(gòu)建體或50mmol/L miR-neg或miR-204-5p mimic共轉(zhuǎn)染。48h后收集細(xì)胞，并用雙熒光素酶報告系統(tǒng)測量海腎熒光素酶活性。

9.Western blot法檢測:裂解細(xì)胞并使用BCA法測量蛋白質(zhì)濃度。變性蛋白30mg通過12% SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5% 脫脂牛奶在Tris緩沖鹽水中室溫封閉1h，并與一抗孵育IL-11和GAPDH在4℃過夜，然后在常溫下孵育二抗辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗兔IgG。通過化學(xué)ECL發(fā)光顯影蛋白質(zhì)條帶。

結(jié) 果

1.miR-204-5p在TPC-1和BCPAP細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)：筆者評估了正常人甲狀腺細(xì)胞NTHY-ORI 3-1和兩種PTC細(xì)胞中miR-204-5p的表達(dá)水平。qRT-PCR的結(jié)果顯示，與正常細(xì)胞比較，TPC-1和BCPAP細(xì)胞系中的miR-204-5p水平顯著降低(P<0.05，圖1)。這些數(shù)據(jù)表明miR-204-5p在PTC細(xì)胞中顯著下調(diào)。

圖1 miR-204-5p在TPC-1和BCPAP細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)

2.miR-204-5p抑制TPC-1細(xì)胞增殖：由于miR-204-5p在TPC-1的表達(dá)水平更低，因此筆者選擇TPC-1進(jìn)行后續(xù)試驗。隨后筆者探索了miR-204-5p在TPC-1細(xì)胞中的生物學(xué)功能。TPC-1細(xì)胞用表達(dá)帶有miR-204-5p或者miR-neg的慢病毒感染，qRT-PCR驗證顯示，miR-204-5p在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的表達(dá)顯著增加(P<0.05，圖2)。MTT結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染miR-neg細(xì)胞比較，細(xì)胞存活率明顯降低(P<0.05，圖3A),并且在平板克隆試驗中也顯示了轉(zhuǎn)染miR-204-5p可以降低細(xì)胞增殖率(P<0.05，圖3B)。

圖2 TPC-1細(xì)胞過表達(dá)處理后miR-204-5p表達(dá)水平

圖3 miR-204-5p抑制TPC-1細(xì)胞增殖

3.miR-204-5p促進(jìn)TPC-1細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯：流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示與miR-neg轉(zhuǎn)染細(xì)胞比較，轉(zhuǎn)染miR-204-5p增加了TPC-1的細(xì)胞凋亡率(P<0.05，圖4A)。并上調(diào)G0/G1的比值(P<0.05)和降低了S期細(xì)胞的比例(P<0.05，圖4B)，表明miR-204-5p促進(jìn)了TPC-1在S2期的細(xì)胞阻滯。

圖4 miR-204-5p促進(jìn)TPC-1細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯

4.miR-204-5p通過靶向結(jié)合3′-UTR抑制IL -11表達(dá)：TargetScanHuman 7.1預(yù)測了IL-11 3′-UTR與miR-204-5p存在高度保守的結(jié)合位點(圖5A)。雙熒光素酶報告分析結(jié)果顯示，miR-204-5p的轉(zhuǎn)染降低了野生型IL-11 3′-UTR的HEK293T細(xì)胞中的相對熒光素酶活性(P<0.05)，但在轉(zhuǎn)染了3′-UTR且miR-204-5p突變結(jié)合位點的細(xì)胞中，該活性基本未改變(圖5B)。

圖5 miR-204-5p與IL-11 3′-UTR存在靶向關(guān)系

5.miR-204-5p與IL-11存在負(fù)性調(diào)節(jié)關(guān)系：qRT-PCR的結(jié)果顯示過表達(dá)miR-204-5p會降低IL-11 mRNA的水平(P<0.05)，而敲減miR-204-5p則顯示出相反的結(jié)果(P<0.05，圖6)，與mRNA的結(jié)果一致，蛋白表達(dá)也觀察到了類似的結(jié)果。

圖6 miR-204-5p與IL-11存在負(fù)性調(diào)節(jié)關(guān)系

討 論

miRNA通過調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)在癌癥的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用，它們可以在功能上區(qū)分為促癌因子和抑癌因子[15,16]。作為一種腫瘤抑制因子，miR-204-5p在結(jié)直腸癌中下調(diào)并與不良預(yù)后相關(guān)，過表達(dá)miR-204-5p可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲并誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[17]。miR-204-5p可抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的克隆生長、遷移和侵襲以及移植瘤體的生長[18]。本研究中miR-204-5p在PTC細(xì)胞中顯著降低。生物學(xué)功能分析表明，miR-204-5p可以抑制細(xì)胞活力和增殖能力，阻斷細(xì)胞周期進(jìn)程，增強(qiáng)細(xì)胞凋亡。

Wang等[19]研究發(fā)現(xiàn)，IL-11通過NF-κB/microRNA-204/血小板生成素調(diào)節(jié)軸促進(jìn)了造血干細(xì)胞移植療法在再生障礙性貧血小鼠模型中的治療效果。miR-204-5p可以影響食管癌細(xì)胞和小鼠模型中的增殖、侵襲、凋亡和細(xì)胞周期[20]。既往研究顯示，IL-11與miR-204-5p存在負(fù)性調(diào)節(jié)關(guān)系。Tang等[20]研究表明，miR-204-5p與IL-11的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，而IL-11的過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-204-5p在細(xì)胞系中的癌癥抑制作用。Liang等[21]研究顯示，IL-11是miR-204-5p的下游靶標(biāo)，lncRNA脫氧鳥苷激酶反義RNA1(lncRNA deoxyguanosine kinase antisense RNA1，DGUOK-AS1)可以保護(hù)IL-11免受miR-204-5p介導(dǎo)的降解，從而起到促進(jìn)乳腺癌的發(fā)展進(jìn)程。在本研究中，筆者通過生物信息學(xué)預(yù)測和熒光素酶活性測定證實IL-11是miR-204-5p的靶標(biāo)。發(fā)現(xiàn)通過過表達(dá)或敲減miR-204-5p的表達(dá)分別可以引起IL-11的下調(diào)或者上調(diào)，這表明了二者之前存在負(fù)性調(diào)節(jié)關(guān)系。在隨后的研究中筆者還會在其他類型的PTC細(xì)胞上進(jìn)行評估m(xù)iR-204-5p的生物學(xué)功能并進(jìn)行在體荷瘤實驗。

綜上所述，miR-204-5p作為腫瘤抑制因子，可能通過調(diào)控下游靶基因IL-11的表達(dá)來調(diào)控PTC細(xì)胞的生物學(xué)行為。結(jié)果表明，miR-204-5p可能是一種有用的診斷標(biāo)志物和潛在的治療分子。