周 姍 趙桉煦 趙芳玲 洪 蕓 陳 浩 劉 健 羅慶鋒 楊杰孚 蔡劍平 戴大鵬

現(xiàn)代醫(yī)療離不開(kāi)藥物，但患者對(duì)藥物治療的反應(yīng)存在較大的個(gè)體差異，只有50%～75%的患者對(duì)藥物治療干預(yù)反應(yīng)充分，而其他患者要么療效欠佳，要么遭受不良反應(yīng)事件[1，2]。藥物治療結(jié)果可被多種因素影響，如環(huán)境因素(共同用藥、飲食、吸煙等)、生理因素(性別、年齡、伴生疾病等)和遺傳因素，其中遺傳變異可解釋20%～30%的不同治療結(jié)局[3]。隨著對(duì)基因型-藥物反應(yīng)關(guān)系理解的不斷加深，美國(guó)食品和藥品監(jiān)督管理局和歐洲藥品管理局針對(duì)醫(yī)療機(jī)構(gòu)發(fā)布了含藥物遺傳學(xué)信息的藥品標(biāo)簽，近年來(lái)其數(shù)量呈現(xiàn)出不斷遞增的趨勢(shì)[4]。根據(jù)臨床藥物基因組學(xué)實(shí)施聯(lián)盟(Clinical Pharmacogenetics Implementation Consortium，CPIC)發(fā)布的指南，目前已有119種基因被認(rèn)為具有藥物遺傳學(xué)活性，如HLA、CYP、MTH2、VKORC1等。

細(xì)胞色素P450(cytochrome P450, CYP)是人體內(nèi)主要的藥物代謝酶，它們能催化代謝多種內(nèi)源、外源物質(zhì)，通過(guò)結(jié)構(gòu)中存在的鐵離子傳遞電子氧化異源物，增強(qiáng)異源物的水溶性使其更易排出體外[5]。CPIC發(fā)布的被認(rèn)為具有藥物遺傳學(xué)活性的基因中，包含多個(gè)CYP的亞家族，如CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6等，其中CYP2C9是CYP2亞家族中的重要成員，約占肝微粒體P450蛋白總量的20%，約有16%的臨床藥物經(jīng)由CYP2C9代謝[6]。已有研究表明，CYP2C9編碼基因的遺傳多態(tài)性可顯著改變CYP酶的藥物代謝活性，進(jìn)而影響藥物的體內(nèi)代謝情況，并導(dǎo)致可能的藥物不良反應(yīng)的發(fā)生，尤其是針對(duì)像華法林這類(lèi)低治療窗的藥物時(shí)更為顯著[7]。

前期研究中，筆者針對(duì)中國(guó)漢族人群建立了國(guó)際范圍內(nèi)單一民族最大的CYP2C9等位基因遺傳多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(kù)，共檢測(cè)到14種已知等位基因，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)了22種新的非同義突變，其中的21種被國(guó)際人類(lèi)CYP等位基因命名委員會(huì)命名為新等位基因CYP2C9*36～CYP2C9*56，后續(xù)研究中筆者又發(fā)現(xiàn)了4種CYP2C9新變異類(lèi)型，即CYP2C9*58、CYP2C9*59、CYP2C9*60、CYP2C9*62[8～12]。研究結(jié)果表明，漢族人群中可能還存在許多未被發(fā)現(xiàn)的CYP2C9突變類(lèi)型。本研究對(duì)近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的另外一種CYP2C9新變異體A149V進(jìn)行了體外重組表達(dá)，并在此基礎(chǔ)上開(kāi)展了藥物代謝活性研究。

材料與方法

1.材料：FineQuick快速磁珠法血液基因組提取試劑盒購(gòu)自常州濟(jì)凡生物科技有限公司；2×Rapid Taq Master Mix購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；PrimeSTAR Max DNA Polymerase 高保真擴(kuò)增酶、EcoRⅠ及SalⅠ限制性內(nèi)切酶、DNA連接試劑均購(gòu)自日本TaKaRa Bio公司；PCR擴(kuò)增及測(cè)序用引物均由北京擎科生物科技有限公司合成；草地貪夜蛾昆蟲(chóng)細(xì)胞(Sf21)、Sf- 900TMⅢ SFM昆蟲(chóng)培養(yǎng)基、胎牛血清和Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；雙表達(dá)桿狀病毒載體pFastBac-OR為實(shí)驗(yàn)室自主構(gòu)建[13]；兔多克隆CYP2C9抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；小鼠單克隆CYPOR抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司。甲苯磺丁脲和氯沙坦購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich 公司。雙氯芬酸購(gòu)自日本東京化學(xué)工業(yè)公司。NADPH購(gòu)自美國(guó)Promega公司。高效液相色譜級(jí)溶劑購(gòu)自美國(guó)Fisher Scientific公司。所有使用的其他化學(xué)物質(zhì)和溶劑都是分析級(jí)或更高等級(jí)。

2.樣本采集及CYP2C9基因分型分析:本研究隨機(jī)采集2018年北京醫(yī)院心內(nèi)科京籍漢族患者的全血樣本，所有納入實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象均已簽署知情同意書(shū)，本研究已獲北京醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)審批(倫理批件號(hào)：2021BJYYEC-324-01)。取200μl EDTA抗凝全血樣本，參照FineQuick快速磁珠法血液基因組提取試劑盒使用說(shuō)明，利用全自動(dòng)核酸提取純化儀(常州濟(jì)凡生物科技有限公司)提取基因組DNA。利用2×Rapid Taq Master Mix參照先前報(bào)道的方法開(kāi)展CYP2C9基因啟動(dòng)子區(qū)及外顯子區(qū)擴(kuò)增，產(chǎn)物切膠回收后送北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司開(kāi)展Sanger測(cè)序[13～16]。PharmVar網(wǎng)站下載CYP2C9的參考序列(NG_ 008385.1)，使用Lasergene(Version：7.1.0)軟件的Seqman組件將獲得的測(cè)序序列與參考序列進(jìn)行比對(duì)分析，并參照PharmVar網(wǎng)站中列出的等位基因信息，對(duì)入組樣本進(jìn)行CYP2C9基因分型分析。

3.表達(dá)載體的構(gòu)建和重組CYP2C9蛋白的表達(dá)：參照先前報(bào)道的重疊延伸PCR擴(kuò)增方法，構(gòu)建典型CYP2C9缺陷型變異體CYP2C9*3[13～16]。同時(shí)利用引物5′-AGAGGAAGtCCGCTGCC-3′及5′-GGCAGCGGaCTTCCTCT-3′(突變位點(diǎn)用小寫(xiě)字母標(biāo)注)通過(guò)兩輪PCR擴(kuò)增將446C>T突變引入CYP2C9 cDNA，從而獲得新變異體A149V的編碼區(qū)全長(zhǎng)片段。擴(kuò)增產(chǎn)物切膠純化后利用EcoRⅠ及SalⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物純化后連接至pFastBac Dual-OR載體，得到雙表達(dá)桿狀病毒載體pFastBac-OR-CYP2C9。載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10Bac后，利用M13F及M13R引物篩選陽(yáng)性克隆并提取桿粒DNA。參照Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)說(shuō)明書(shū)，轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞Sf21獲得同時(shí)表達(dá)CYP2C9及CYPOR的昆蟲(chóng)病毒懸液，并用于昆蟲(chóng)細(xì)胞中大量表達(dá)CYP2C9和CYPOR(cytochrome P450 oxidoreductase)。采用差速離心法制備昆蟲(chóng)微粒體， Western blot法驗(yàn)證CYP2C9和CYPOR的表達(dá)，利用CYP2C9標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)表達(dá)的各CYP2C9變異體進(jìn)行目的蛋白定量分析。

4.酶動(dòng)力學(xué)分析：參照文獻(xiàn)[13～15]的方法，使用3種CYP2C9探針?biāo)幬?雙氯芬酸、甲苯磺丁脲和氯沙坦)評(píng)估野生型和突變型CYP2C9的藥物代謝活性，使用GraphPad Prism 9.0軟件計(jì)算酶促動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km、Vmax及清除率Clint(Vmax/Km)。使用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，經(jīng)t檢驗(yàn)分析各CYP2C9變異體間的藥代參數(shù)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

本研究通過(guò)對(duì)513例漢族住院患者開(kāi)展了CYP2C9基因遺傳多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)其中1例患者攜帶了一種全新的CYP2C9突變類(lèi)型。測(cè)序結(jié)果表明，新的突變位點(diǎn)位于CYP2C9基因第3外顯子， cDNA第446位(C>T)，會(huì)導(dǎo)致CYP2C9蛋白第149位的丙氨酸被替換為纈氨酸(縮寫(xiě)為A149V)，其測(cè)序峰圖詳見(jiàn)圖1。

圖1 新變異體A149V攜帶者基因測(cè)序峰圖

利用昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)成功重組表達(dá)CYP2C9和CYPOR，經(jīng)蛋白免疫印跡分析。如圖2所示，A149V的蛋白質(zhì)表達(dá)水平與野生型CYP2C9.1、典型突變體CYP2C9.3相近。

圖2 昆蟲(chóng)細(xì)胞微粒體中重組表達(dá)的CYP2C9和CYPOR蛋白免疫印跡分析

為深入研究新突變位點(diǎn)對(duì)CYP2C9酶活性的影響，采用3種CYP2C9典型探針?biāo)幬锛妆交嵌‰?、雙氯芬酸和氯沙坦開(kāi)展了體外藥物代謝活性分析。圖3為這些底物的Michaelis-Menten擬合曲線圖，其中新變異體A149V的代謝活性遠(yuǎn)小于野生型，與典型慢代謝變異體CYP2C9.3相近。表1為重組表達(dá)的3種CYP2C9蛋白針對(duì)3種探針?biāo)幬锏乃幋鷦?dòng)力學(xué)參數(shù)，新變異體A149V針對(duì)3種探針?biāo)幬锏那宄史謩e僅為野生型的17.90%、24.73%和5.54%，提示新變異體A149V的藥物代謝活性由于149位處丙氨酸被替換為纈氨酸而顯著降低。

圖3 CYP2C9微粒體對(duì)3種探針?biāo)幬锎x的酶動(dòng)力學(xué)曲線

表1 CYP2C9各突變型微粒體對(duì)探針?biāo)幬锎x的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)

討 論

本研究在對(duì)中國(guó)漢族志愿者的CYP2C9基因測(cè)序分型篩查工作中發(fā)現(xiàn)了一種全新的CYP2C9變異體A149V，體外酶動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示該變異體的藥物代謝活性明顯降低，為一種慢代謝突變類(lèi)型。前期筆者通過(guò)對(duì)2127例漢族志愿者的基因分型，曾發(fā)現(xiàn)CYP2C9蛋白的第149位氨基酸存在著丙氨酸被蘇氨酸替換(A149T)的變異類(lèi)型，并已被人類(lèi)CYP等位基因命名委員會(huì)命名為CYP2C9*46[8]。隨后的體外功能研究表明，CYP2C9*46為慢代謝突變類(lèi)型并導(dǎo)致其蛋白表達(dá)水平較野生型明顯降低[17]。本研究中A149V的體外結(jié)果與此類(lèi)似。另一方面，在CYP2C9第149位氨基酸附近已有多種變異類(lèi)型被相繼發(fā)現(xiàn)，如CYP2C9*2(R144C)、CYP2C9*8(R150H)、CYP2C9*27(R150L)和CYP2C9*63(R144H)等[18～20]。體內(nèi)外藥物代謝活性研究表明，與野生型CYP2C9*1比較，CYP2C9*2為慢代謝類(lèi)型，CYP2C9*8為快代謝類(lèi)型，CYP2C9*27代謝活性無(wú)明顯改變，而CYP2C9*63活性尚未報(bào)道。這些結(jié)果與本研究結(jié)果共同顯示，CYP2C9的第149位及其周?chē)陌被崛菀壮霈F(xiàn)遺傳變異，同時(shí)這些位點(diǎn)對(duì)于藥物代謝活性的正常維持具有重要作用。

遺傳學(xué)研究表明，新發(fā)現(xiàn)的變異體A149V在全部513例樣本中僅有1例患者攜帶，其基因型頻率僅為0.19%，與其他除CYP2C9*3外的突變型等位基因類(lèi)似，A149V屬于典型的罕見(jiàn)突變類(lèi)型。另一方面，本研究結(jié)果表明，與多數(shù)漢族人群中發(fā)現(xiàn)的罕見(jiàn)型突變體類(lèi)似，A149V也是一種典型的慢代謝型CYP2C9變異體，其針對(duì)雙氯芬酸及氯沙坦的代謝速率甚至低于典型慢代謝類(lèi)型CYP2C9.3，提示攜帶這一突變的個(gè)體在服用經(jīng)由CYP2C9代謝的藥物時(shí)可能會(huì)呈現(xiàn)出比CYP2C9*3等位基因攜帶者更低的藥代特征，進(jìn)而更容易出現(xiàn)藥物不良反應(yīng)，尤其在服用治療窗狹窄的藥物(如抗凝藥物華法林)時(shí)可能需要密切關(guān)注和調(diào)整藥物劑量。結(jié)合既往研究，中國(guó)漢族人群中約有5%的個(gè)體攜帶各種罕見(jiàn)型CYP2C9變異體，通過(guò)遺傳學(xué)研究及時(shí)發(fā)現(xiàn)并進(jìn)一步分析這些罕見(jiàn)變異體的藥代特性，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值[8～12]。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)了一種全新的CYP2C9慢代謝變異體A149V，其人群中的等位基因頻率需開(kāi)展進(jìn)一步的研究予以揭示。這些CYP2C9變異體的發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步豐富了人們對(duì)藥物基因組學(xué)的認(rèn)知, 并為建立適用于我國(guó)漢族人群的個(gè)體化用藥指導(dǎo)原則具有重要的理論指導(dǎo)意義。