曹囡囡 燕江雪 丁 霞 倪 倩

細胞焦亡是一種伴隨著高度炎性反應的程序化細胞死亡形式，為近年來的研究熱點。社區(qū)獲得性呼吸窘迫綜合征毒素(community-acquired respiratory distress syndrome toxin,CARDS Tx)由肺炎支原體(mycoplasma pneumoniae,MP)產(chǎn)生，是已知MP的唯一毒力因子，被細胞內NOD樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)識別后可觸發(fā)細胞焦亡，進而誘發(fā)強烈的炎癥級聯(lián)反應[1]。肺炎支原體肺炎(mycoplasma pneumoniae pneumonia,MPP)為社區(qū)獲得性肺炎(community-acquired pneumonia, CAP)的常見類型之一，MPP患兒癥狀易遷延，若進展為重癥肺炎支原體肺炎(severe mycoplasma pneumoniae pneumonia,SMPP)，則可能累及肺外多系統(tǒng)，嚴重者甚至引起多臟器功能衰竭而危及生命，脫離生命危險者亦可能遺留嚴重后遺癥，影響患兒日后生活質量。隨著耐大環(huán)內酯類MP的感染率逐漸增高，MPP的治療急需新的突破。本文旨在探討細胞焦亡與兒童MPP發(fā)生、發(fā)展的相關性及靶向細胞焦亡通路藥物的研究現(xiàn)狀。

一、細胞焦亡

細胞焦亡屬基因編碼調控的程序化死亡，與細胞壞死的無序且不可控相異，與細胞凋亡的免疫沉默亦不同，細胞焦亡伴隨著強烈的炎性反應，為許多感染性疾病及慢性炎癥性疾病的重要致病因素。炎癥性半胱天冬氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate-specific protease,caspase)是細胞焦亡的關鍵介質，炎癥性caspase包括caspase-1/4/5/11，其中caspase-1/4/5存在于人體內，caspase-1/11存在于小鼠體內[2]。以下詳述由caspase-1介導的經(jīng)典細胞焦亡。機體通過NLRP3炎癥體的活化觸發(fā)caspase-1介導的經(jīng)典細胞焦亡(圖1)。

圖1 CARDS Tx介導NLRP3炎癥體觸發(fā)細胞焦亡

NLRP3是一種胞質型模式識別受體，通常為沉默狀態(tài)，識別相應的病原相關分子模式或危險相關分子模式后，方可被激活參與固有免疫反應。NLRP3炎癥體由NLRP3、凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein,ASC)和caspase-1前體(pro-caspase-1)構成，其中NLRP3為炎癥體的中心分子，由中央的核苷酸寡聚結構域(nucleotide-binding oligomerization domain,NOD)、C端的富含亮氨酸重復序列(leucine-rich repeat,LRR)和N端的熱蛋白結構域(pyrin domain,PYD)構成；ASC由N端的PYD和C端的胱天蛋白酶招募結構域(caspase-activating recruitment domain,CARD)組成，在炎癥體中作為接頭蛋白存在；pro-caspase-1為炎癥體的效應分子[3]。

NLRP3炎癥體的完全活化需要雙重信號的刺激，第一信號促進NF-κB的激活，上調NLRP3和IL-1β前體(pro-IL-1β)、IL-18前體(pro-IL-18)的表達，為NLRP3炎癥體的活化提供物質準備；第二信號直接激活NLRP3，啟動炎癥體的組裝[4]。NLRP3的LRR域識別第二活化信號后，NOD結構域發(fā)生寡聚化，隨后暴露N端的PYD結構域，開始募集接頭蛋白ASC；ASC的PYD區(qū)可與NLRP3-N端的PYD結構域相互作用，后將信號傳遞給ASC-C端的CARD區(qū)，進而募集同樣含有CARD結構域的pro-caspase-1，pro-caspase-1自我切割產(chǎn)生成熟的caspase-1[5]。

消皮素D(gasdermin D,GSDMD)為細胞焦亡的主要效應因子。GSDMD包含N端和C端兩個結構域，C端對N端具有抑制作用，當兩結構域相互結合時GSDMD處于無活性狀態(tài)?；罨腸aspase-1可有效切割GSDMD的天冬氨酸位點，導致C端與N端解離，使GSDMD的N端活性結構域得以釋放并發(fā)揮活性作用。GSDMD-N結構域在細胞膜中插入多種脂質成分，組裝成弧形的低聚物后逐漸變?yōu)楦蟮目p隙狀，最終轉為穩(wěn)定的環(huán)型GSDMD孔隙，致細胞內外滲透壓失衡，鈉離子及水大量進入細胞內，細胞脹破、裂解，細胞內容物游離至細胞外，誘導死亡細胞周圍發(fā)生強烈的炎性反應[6]?；罨腸aspase-1亦剪切pro-IL-1β和pro-IL-18，產(chǎn)生成熟的IL-1β和IL-18，并經(jīng)細胞膜上孔隙轉運至細胞外，進一步擴大炎性反應[7]。

二、CARDS Tx

CARDS Tx由591個氨基酸殘基構成，相對分子質量為68000，因其可以與哺乳動物呼吸道上皮細胞膜上的表面活性蛋白-A高親和力結合而被發(fā)現(xiàn)[8]。CARDS Tx形似三角形，二級結構為17個α螺旋和43個β折疊，結構中包含1個二硫鍵，對構象的穩(wěn)定及活性的執(zhí)行具有關鍵作用[9]。CARDS Tx的N端結構域與其生物活性相關，中段結構域介導CARDS Tx內化進入靶細胞，C端結構域包含多個抗原表位，可誘導特異性抗體產(chǎn)生[10]。CARDS Tx需進入細胞內發(fā)揮活性作用，CARDS Tx與宿主細胞表面受體結合后，主要通過網(wǎng)格蛋白介導的途徑內化，進入細胞后運輸至內質體和高爾基體，后集中在核周區(qū)通過逆行途徑機制到達內質網(wǎng)處激活其生物活性[11]。

Li等[12]對比MPP患兒與支氣管異物患兒BALF中的CARDS Tx水平，結果表明，MPP患兒BALF中的CARDS Tx水平明顯增高。CARDS Tx作為MP的毒力因子，具有致細胞空泡化作用與腺苷二磷酸核糖基轉移酶(ADP ribosyltransferase,ART)活性。致細胞空泡化作用表現(xiàn)為在細胞核周圍形成空泡，逐漸融合并將細胞核擠壓至一側，導致細胞受損甚至死亡[8]。ART活性表現(xiàn)為將煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的ADP核糖基團轉移到目標蛋白的特定氨基酸后釋放煙酰胺，是一種可逆的蛋白翻譯后共價修飾作用，可以改變靶分子的生物活性[9]。

三、細胞焦亡在MPP中的致病作用

Liu等[13]研究表明，在MP感染的細胞模型中，NLRP3、caspase-1、GSDMD-N結構域、IL-1β、IL-18的表達均顯著上調，并發(fā)現(xiàn)MP感染患兒外周血單核細胞中NLRP3、IL-1β、IL-18的mRNA表達明顯高于健康兒童。CARDS Tx的ART活性可對NLRP3受體蛋白進行翻譯后修飾，使其分子構象發(fā)生改變，從而激活NLRP3(圖1)。MP黏附于呼吸道上皮細胞表面，通過Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)實現(xiàn)一系列信號轉導，預激活靶細胞內NLRP3，隨之MP釋放的CARDS Tx內化進入靶細胞，啟動NLRP3炎癥體的組裝。活化的NLRP3炎癥體激活下游的細胞焦亡通路，大量IL-1β和IL-18被釋放至細胞外，發(fā)揮強大的促炎作用(圖1)。

IL-1β具有極強的促炎活性，激活IL-1受體后誘導多種細胞因子快速表達，短期內大量細胞因子的分泌致機體出現(xiàn)細胞因子風暴[15]。IL-1β可募集活化的中性粒細胞，釋放多種酶造成組織損害，引起中性粒細胞浸潤性炎癥，亦可趨化巨噬細胞、肥大細胞至炎癥部位，產(chǎn)生CCL2、CCL3、CXCL8等趨化因子、IL-1、TNF-α等炎性細胞因子和白三烯、前列素D2等炎性介質，造成嚴重的細胞壞死及組織損傷[16]。IL-18可明顯促進NK細胞活化，NK細胞釋放的TNF-α與TNF受體結合后可預激活NLRP3，產(chǎn)生滾雪球效應[17]。Dima等[18]研究發(fā)現(xiàn)，IL-18過度表達可使小鼠發(fā)生肺氣腫病變，提示IL-18可能誘導MPP患兒肺部發(fā)生慢性炎性反應和氣道重塑。

四、靶向經(jīng)典細胞焦亡通路的藥物研究現(xiàn)狀

1.褪黑素(melatonin, MLT)：MLT是機體分泌的一種胺類激素，具有晝夜節(jié)律調節(jié)、抗氧化、抗炎等活性。Zhu等[19]將小鼠角膜進行同種異體移植，發(fā)現(xiàn)MLT可通過降低NLRP3、ASC、IL-1β等的表達量減少移植物中炎性細胞浸潤，并提高移植物的存活率。Yu等[20]研究發(fā)現(xiàn)，MLT處理糖尿病伴隨肝臟脂肪變性的小鼠后，小鼠肝臟中NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18的表達顯著下調，小鼠的脂肪性肝炎、血糖、血脂、體質量等明顯好轉。

2.奧曲肽：奧曲肽為生長抑素類似物，相比生長抑素，持續(xù)作用時間更長。El-Sisi等[21]使用奧曲肽處理肝臟缺血再灌注損傷小鼠后，小鼠肝臟組織中NLRP3、ASC、caspase-1、GSDMD-N結構域的表達量顯著降低，肝臟的病理表現(xiàn)得到改善，表明奧曲肽可有效抑制細胞焦亡通路，該研究還對比了MLT與奧曲肽處理肝臟缺血再灌注損傷小鼠的結局，奧曲肽的抗炎作用優(yōu)于MLT。

3.艾司洛爾：艾司洛爾是一種短效β1腎上腺素受體阻滯劑，常用于心血管系統(tǒng)疾病的治療。李盼等[22]研究發(fā)現(xiàn)，艾司洛爾可顯著下調膿毒癥大鼠NLRP3、caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18的表達，心肌細胞死亡得到明顯改善，提示艾司洛爾可降低細胞焦亡通路中各因子的表達，減輕細胞焦亡所致的機體損傷。艾司洛爾相比同類型藥物，改善心功能的作用顯著，對于伴隨心力衰竭的MPP患兒或具有較好的療效，值得進一步研究。

4.吡非尼酮：吡非尼酮為吡啶酮類似物，臨床上主要用于治療特發(fā)性肺纖維化，具有抗纖維化、抗炎特性，可有效改善肺通氣功能，延緩病情進展。近年來研究發(fā)現(xiàn)，吡非尼酮通過抑制NLRP3炎癥體實現(xiàn)其抗炎作用。Sharawy等[23]用吡非尼酮處理急性腎損傷大鼠后，TLR4、NF-κB、NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18的表達顯著降低，腎功能亦明顯好轉。Li 等[24]研究發(fā)現(xiàn)，吡非尼酮可顯著下調急性肺損傷小鼠肺組織中NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β的表達，并明顯減輕肺部炎癥及纖維化，體外細胞實驗發(fā)現(xiàn)吡非尼酮預處理可降低細胞中caspase-1、IL-1β的表達水平，表明吡非尼酮可通過抑制NLRP3炎癥體減少IL-1β的分泌，從而改善肺部病理表現(xiàn)。

5.他汀類藥物：他汀類藥物是一類羥甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑，廣泛應用于高脂血癥、冠心病等疾病的治療。Sun等[25]研究發(fā)現(xiàn)，阿托伐他汀治療草酸鈣腎結石大鼠組TLR4、NF-κB、caspase-1、IL-1β、IL-18的表達較單純草酸鈣腎結石大鼠組明顯降低，草酸鈣結石誘導的腎臟炎癥亦明顯減輕。Chen等[26]研究發(fā)現(xiàn)，瑞舒伐他汀可顯著下調NLRP3、caspase-1、GSDMD-N結構域、IL-1β的表達，從而改善冠狀動脈微栓塞后的心臟收縮功能及形態(tài)變化，減小心肌微梗死面積。Kang等[27]研究表明，門診應用他汀類藥物可降低CAP患者的住院率，但未針對某一病原體細致研究，結合他汀類藥物可抑制細胞焦亡通路，其是否可改善MPP的疾病進展值得深入探究。

6.西維來司他：西維來司他是一種中性粒細胞彈性蛋白酶選擇性抑制劑，臨床上主要用于改善急性肺損傷、急性呼吸窘迫綜合征的肺通氣。韓艷奇等[28]使用西維來司他處理急性肺損傷小鼠，結果提示西維來司他處理后可顯著下調小鼠肺組織中NLRP3、caspase-1、IL-18的表達，與NLRP3抑制劑處理后相似，均可減輕小鼠肺部病理損傷，表明西維來司他可抑制NLRP3炎癥體介導的細胞焦亡通路。

7.右美托咪定：右美托咪定是一種選擇性α2腎上腺素受體激動劑，臨床上主要用于麻醉或機械通氣過程中的鎮(zhèn)靜。近年來，右美托咪定的抗炎作用備受關注。Ding等[29]在利多卡因誘導的脊髓損傷大鼠模型中研究發(fā)現(xiàn)，右美托咪定通過抑制NLRP3炎癥體的組裝，減少細胞焦亡下游促炎性細胞因子IL-1β、IL-18的產(chǎn)生，從而明顯減輕大鼠脊髓損傷的嚴重程度。Zhang等[30]研究發(fā)現(xiàn)，右美托咪定可破壞NLRP3炎癥體的組裝過程，減少成熟的caspase-1形成，最終降低IL-1β的表達，減輕由NLRP3炎癥體誘導的焦亡相關炎癥。

五、展 望

本文綜述了CARDS Tx激活NLRP3炎癥體后介導的細胞焦亡對MPP的致病作用及MLT、奧曲肽、艾司洛爾、吡非尼酮、他汀類藥物、西維來司他、右美托咪定對經(jīng)典細胞焦亡通路的抑制作用。MP為兒童呼吸道感染的常見病原體，感染后可出現(xiàn)多種肺內外癥狀，且易發(fā)生頑固、反復的感染，隨著大環(huán)內酯類耐藥型MPP的增多，臨床上急需新型靶向藥物的出現(xiàn)，文中所述藥物在MPP治療中的應用值得開展更深層次、更細致的研究。