朱業(yè)寶，陳立喆，王金英，江 川

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所/福建省稻種質(zhì)資源庫(kù)（圃），福建福州350018）

關(guān)鍵字：水稻；優(yōu)質(zhì)；稻瘟病抗性基因；恢復(fù)系

水稻是中國(guó)最主要的糧食作物之一，以大米為主食占比超過(guò)一半，其對(duì)國(guó)家糧食安全起到重要作用。稻瘟病是水稻生產(chǎn)的重要病害之一。生產(chǎn)實(shí)踐表明，培育和利用抗稻瘟病品種是最經(jīng)濟(jì)、有效防控稻瘟病的手段［1］。然而，由于稻瘟病菌株會(huì)發(fā)生定向變異，攜帶有單一或少數(shù)稻瘟病抗性基因的品種會(huì)隨著種植年限的增長(zhǎng)，品種抗性會(huì)逐漸喪失［2］。因此，篩選并應(yīng)用新的抗病種質(zhì)資源，將對(duì)應(yīng)于各種稻瘟病菌無(wú)毒基因的水稻抗性基因都聚合到同一栽培品種中，有助于培育廣譜、持久稻瘟病抗性新品種，對(duì)于水稻穩(wěn)產(chǎn)、減少農(nóng)藥的使用量，降低生產(chǎn)成本，減少污染,保證糧食安全均具有重要的意義。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，國(guó)內(nèi)外已克隆稻瘟病抗性基因至少有35個(gè)［3］，為稻瘟病抗性基因的檢測(cè)和利用提供重要保障。目前，科研工作者對(duì)稻瘟病抗性基因在水稻種質(zhì)資源的分布進(jìn)行了較多的研究［4-8］，這些研究為分子標(biāo)記輔助選擇在新品種選育研究方面奠定了基礎(chǔ)。在分子標(biāo)記輔助選擇育種也有較多研究者開(kāi)展此項(xiàng)研究。陳建民等［9］利用與抗白葉枯病基因Xa23和抗稻瘟病基因Pi9連鎖的標(biāo)記，將這2個(gè)抗性基因聚合到感病雜交稻恢復(fù)系閩恢3139，改良株系所配組合基本保持閩恢3139的農(nóng)藝性狀和配合力，可直接應(yīng)用于生產(chǎn)或作抗性育種親本。倪大虎等［10］利用分子標(biāo)記輔助選擇和傳統(tǒng)育種相結(jié)合的方法，將稻瘟病基因Pi9和抗白葉枯基因Xa21和Xa23聚合于同一株系中，獲得了4個(gè)三基因聚合且農(nóng)藝性狀較好株系。閆成業(yè)等［11］通過(guò)雜交、回交和分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)，將抗褐飛虱基因Bph14和Bph15基因同時(shí)導(dǎo)入到水稻恢復(fù)系R1005中，獲得3個(gè)含雙基因株系，其中2個(gè)株系的農(nóng)藝性狀和R1005相近。陳紅旗等［12］利用基因重組技術(shù)結(jié)合MAS技術(shù)，將分別攜帶稻瘟病抗性基因Pi-1和Pi-33和Pi-22個(gè)材料導(dǎo)入金23B中，抗病頻率提高到96.7%，說(shuō)明隨著稻瘟病抗性基因聚合數(shù)目的增加，抗譜也顯著拓寬。前人研究結(jié)果進(jìn)一步證明，分子標(biāo)記輔助選擇改良材料稻瘟病抗性是切實(shí)可行的。

本研究通過(guò)前期已篩選到的攜帶多個(gè)稻瘟病抗性基因的國(guó)外引進(jìn)種質(zhì)資源IR79193-83-1-1-1為親本［13］，通過(guò)雜交將抗病基因轉(zhuǎn)移到恢復(fù)系材料中，對(duì)分離世代的不同基因組合材料進(jìn)行稻瘟病田間抗性鑒定，同時(shí)對(duì)分離世代進(jìn)行堿消值和堊白等米質(zhì)性狀進(jìn)行篩選，以期篩選到米質(zhì)優(yōu)、稻瘟病抗性強(qiáng)的新材料，為培育具有稻瘟病抗性強(qiáng)的優(yōu)質(zhì)水稻新品種打下理論與實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

抗性供體親本：國(guó)外引進(jìn)抗性材料IR79193-83-1-1-1；抗性受體親本：恢復(fù)系親本幫恢609。

1.2 DNA提取和檢測(cè)

按Wang 的SDS抽提法提取水稻基因組DNA［14］。用于PCR擴(kuò)增的引物相關(guān)信息見(jiàn)表1。引物由華大基因合成。研究選取稻瘟病基因Pi9、Pi5、Pikm、Pita4個(gè)基因，其功能標(biāo)記PCR擴(kuò)增方法參照表1相應(yīng)文獻(xiàn)。PCR產(chǎn)物檢測(cè)在6%非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳，用4S GelRed核酸染料染色后，在凝膠成像系統(tǒng)上拍照。為確保結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，每個(gè)樣品擴(kuò)增2次。

表1 稻瘟病相關(guān)基因的基因型鑒定涉及的引物序列及相關(guān)信息

1.3 群體構(gòu)建與后代篩選

2016年海南以幫恢609為母本，IR79193-83-1-1-1為父本配制雜交組合，2017年將樂(lè)中稻種植F1，2017年海南陵水種植2 000株F2，通過(guò)表型篩選獲得株葉態(tài)較好材料105份，從F2開(kāi)始，每代均開(kāi)展米質(zhì)和外觀篩選和稻瘟病基因分子標(biāo)記輔助選擇，獲得惡白粒率低、堿消值高、攜帶抗病基因品系，并在上杭茶地稻瘟病鑒定基地進(jìn)行抗性鑒定，通過(guò)連續(xù)多代的重復(fù)篩選與鑒定，獲得了抗性好，米質(zhì)好的品系。

1.4 稻瘟病抗性鑒定

稻瘟病自然誘發(fā)鑒定苗瘟，鑒定點(diǎn)選在福建省上杭縣茶地鎮(zhèn)的國(guó)家、省級(jí)水稻新品種抗性鑒定示范基地，該鑒定點(diǎn)屬福建省水稻稻瘟病常發(fā)病、重發(fā)病地區(qū)，旱圃法鑒定，按0～9級(jí)標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查病情，調(diào)查和評(píng)價(jià)參照統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行［19］。

1.5 表型性狀鑒定

農(nóng)藝性狀評(píng)價(jià)于2020年在海南陵水試驗(yàn)田進(jìn)行，考察性狀包含成熟期、株高、有效穗、穗長(zhǎng)、穗粒數(shù)、結(jié)實(shí)率、谷粒長(zhǎng)度，谷粒寬度、千粒重等性狀，谷粒性狀用萬(wàn)深大米外觀品質(zhì)檢測(cè)儀（型號(hào)：SC-E）采集數(shù)據(jù)。農(nóng)藝性狀、惡白粒率和堿消值評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)參照水稻種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)［20］。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本抗性、米質(zhì)外觀及堿消值檢測(cè)

對(duì)親本幫恢609和IR79193-83-1-1-1進(jìn)行稻瘟病自然誘發(fā)鑒定、堿消值測(cè)定和惡白粒率鑒定，結(jié)果表明幫恢609表現(xiàn)感病，堿消值為3級(jí)，惡白粒率85%左右，IR79193-83-1-1-1表現(xiàn)抗病，堿消值為7級(jí)，惡白粒率5%左右。

2.2 分子標(biāo)記輔助改良幫恢609的稻瘟病抗性

表型篩選獲得株葉態(tài)較好材料105份，利用與Pi9、Pi5、Pikm、Pita等4個(gè)基因的功能性分子標(biāo)記對(duì)材料進(jìn)行檢測(cè)，選擇含有抗性基因的單株加代選擇，并在隔代上杭茶地進(jìn)行稻瘟病抗性鑒定，最終篩選出5份農(nóng)藝性狀優(yōu)良、群體穩(wěn)定的、含有目標(biāo)基因（Pi9、Pi5）且田間表現(xiàn)抗稻瘟病的高代株系材料。

2.3 改良恢復(fù)系的主要農(nóng)藝性狀分析

從F2代開(kāi)始即對(duì)表型篩選獲得株葉態(tài)較好材料進(jìn)行惡白粒率和堿消值鑒定篩選，在低世代篩選高堿消值株系，后代遺傳力高，低世代株系堿消值高且無(wú)分離，該株系下一代基本為堿消值高的材料，惡白粒率性狀的低世代篩選能提高效率。因此，在低世代進(jìn)行堿消值和惡白率篩選很有必要，可以極大減少工作量。對(duì)5份改良系和親本在海南陵水成熟期進(jìn)行農(nóng)藝性狀調(diào)查（表2）。從表中可以看出，創(chuàng)制的5個(gè)株系，有效改良了堿消值和惡白情況，基本聚合了2個(gè)親本的優(yōu)良性狀。

表2 親本及后代材料的表型考察結(jié)果

3 討論

稻瘟病抗性和優(yōu)質(zhì)稻育種一直是育種家的關(guān)注焦點(diǎn)。隨著眾多抗稻瘟病基因的定位和克隆，相關(guān)基因標(biāo)記的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用已成為水稻抗稻瘟病育種最重要的手段之一［21-23］。分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)是隨著分子生物學(xué)及生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展而產(chǎn)生的新的選擇手段，分子標(biāo)記輔助選擇不受基因表達(dá)、環(huán)境條件及植株生長(zhǎng)發(fā)育階段的影響，也不受雜交方式的影響，在植株的苗期或低世代即可進(jìn)行篩選，具有較多的優(yōu)點(diǎn)，特別是表型鑒定比較困難或表型檢測(cè)費(fèi)時(shí)費(fèi)力的目標(biāo)性狀。本研究采用一次雜交，低世代進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇，結(jié)合稻瘟病抗性鑒定，能在低世代即可淘汰非目標(biāo)性狀株系，減少工作量并增加了選擇效率。

稻瘟病基因常與不良性狀連鎖［24］，本研究采用連續(xù)多代的堿消值測(cè)定和惡白粒率篩選，能夠快速獲得堿消值高，惡白粒率低的材料，減少工作量，避免了品種選育的盲目性，證明加強(qiáng)對(duì)分離低世代目標(biāo)性狀鑒定篩選是優(yōu)質(zhì)稻育種的有效途徑。

研究利用已知攜帶抗稻瘟病基因，且米質(zhì)外觀好，堿消值高的外引種質(zhì)資源，與配合力好，但惡白粒率高和堿消值偏低的恢復(fù)系材料幫恢609雜交，通過(guò)對(duì)分離世代連續(xù)多代分子標(biāo)記輔助選擇、田間稻瘟病抗性鑒定、外觀篩選和堿消值測(cè)定，最終獲得5份攜帶多個(gè)抗稻瘟病基因，且米質(zhì)外觀好、堿消值高、抗稻瘟病強(qiáng)的中間材料，為下一步雜交水稻新品種選育和種質(zhì)創(chuàng)新提供材料。