劉艷艷，薛凌展*，傅建軍，吳妹英，陳宇舒，廖夢(mèng)香，陳度煌，胡振禧，林學(xué)文，董在杰，樊海平，吳 斌

(1.福建省淡水水產(chǎn)研究所，福建 福州 350002；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水漁業(yè)與種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214081)

大刺鰍(Mastacembelusarmatus)隸屬于合鰓目(Symbranchiformes)、刺鰍科(Mastacembelidae)、刺鰍屬(Mastacembelus)[1-2]，主要分布在福建、廣東、湖南、云南、海南等南方省份[3-4]，屬于淡水名特優(yōu)物種，其味道鮮美，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，深受山區(qū)人們的喜愛，福建和廣東等地區(qū)的市場(chǎng)價(jià)格高達(dá)160～200元/kg。關(guān)于大刺鰍的人工養(yǎng)殖技術(shù)尚未成熟，市場(chǎng)需求主要依靠捕撈野生資源，導(dǎo)致野生資源面臨枯竭的危險(xiǎn)[5-6]，因此發(fā)展大刺鰍人工養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)迫在眉睫?，F(xiàn)有的大刺鰍苗種多以野生親本繁殖而來，具有一定的野性，在人工養(yǎng)殖過程中容易出現(xiàn)應(yīng)激性死亡現(xiàn)象，養(yǎng)殖成活率低。此外，缺乏科學(xué)的制種技術(shù)工藝和親本管理保存制度，導(dǎo)致市場(chǎng)上流通的苗種種質(zhì)混亂，遺傳背景不清晰，不利于該物種的產(chǎn)業(yè)化。目前國(guó)內(nèi)外針對(duì)大刺鰍開展了大量的研究，主要集中在人工繁殖[7-8]、養(yǎng)殖技術(shù)研究[9]、病害防治[10-11]、營(yíng)養(yǎng)需求[12]、遺傳多樣性分析[13]、生物學(xué)特性研究[14]等方面，而針對(duì)大刺鰍遺傳育種工作尚未見報(bào)道。因此對(duì)大刺鰍開展定向遺傳育種改良工作具有重要的意義。

全同胞家系選育是家系選育技術(shù)的一種，可分析表型和追溯每個(gè)個(gè)體的譜系情況，結(jié)合數(shù)量性狀經(jīng)過多代定向選育，獲得新品種或新品系，提升養(yǎng)殖效率。目前家系選育已被廣泛應(yīng)用于凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)[15]、斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeusmonodon)[16]、菲利賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)[17]、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)[18]、紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)[19]和大西洋鮭(Salmosalar)[20]等水產(chǎn)動(dòng)物新品種選育工作。

最佳線性無(wú)偏預(yù)測(cè)法(Best linear unbiased prediction，BLUP)是一種被廣泛應(yīng)用于水稻、畜牧和苗木的遺傳力和育種值評(píng)估方法。相較于其他估算方法，在家系選育中，其能更加精確地估算出每個(gè)個(gè)體的育種值(Estimated breeding value，EBV)和遺傳力(Heritability)等參數(shù)。全同胞家系結(jié)合BLUP估算方法，大大提升了繁育親本選擇的準(zhǔn)確性，有效縮短了育種周期。該育種方法已在大西洋鮭[21]、羅非魚(Oreochromisniloticus)[22]和銀大馬哈魚(Oncorhynchuskisutch)[23]等選育工作中應(yīng)用，并獲得相應(yīng)的新品種和新品系。

在遺傳育種工作中，實(shí)現(xiàn)選育對(duì)象個(gè)體標(biāo)記同池混養(yǎng)、減少環(huán)境干擾因素是魚類選育的關(guān)鍵。常見的標(biāo)記有外掛式標(biāo)記(鼻簽、剪鰭、掛牌、烙印、化學(xué)腐蝕法等)和內(nèi)標(biāo)記(注射染料標(biāo)記、放射同位素標(biāo)記、熒光色素標(biāo)記等)[24]。以上標(biāo)記方法各有各的缺陷，例如容易丟失、無(wú)法辨識(shí)、標(biāo)記難度大、標(biāo)簽成本高等問題，因而無(wú)法被應(yīng)用于長(zhǎng)期選育工作。而被動(dòng)整合雷達(dá)標(biāo)記(Passive integrated transponder，PIT)[25]實(shí)現(xiàn)了個(gè)體水平的標(biāo)記，標(biāo)記時(shí)間長(zhǎng)(10年)，適用于魚種和成魚，讀取率高，不易丟失，被廣泛應(yīng)用于大口黑鱸(Micropterussalmoides)[26]、鯉魚(Cyprinuscarpio)[27]和羅非魚[28]等魚類選育工作中。為進(jìn)一步探究大刺鰍的選育潛力，本研究以野生大刺鰍為親本，將全同胞家系培育技術(shù)、PIT標(biāo)記技術(shù)和BLUP育種值評(píng)估技術(shù)結(jié)合，通過體質(zhì)量的遺傳力和育種值評(píng)估，初步建立了大刺鰍全同胞家系選育技術(shù)工藝，為該物種后續(xù)的遺傳改良和持續(xù)選育提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 全同胞家系構(gòu)建

試驗(yàn)對(duì)象為福建省淡水水產(chǎn)研究所保存在合作基地的大刺鰍全同胞家系。從2020年開始，課題組利用3齡野生成年大刺鰍親本進(jìn)行人工催產(chǎn)[9]，一對(duì)一配對(duì)繁殖。授精后采用脫黏劑進(jìn)行人工脫黏，將每組的受精卵分別放在50 L容器中靜水孵化。水溫控制在26～28℃之間。淘汰受精率和孵化率均低于50%的家系，共計(jì)獲得存活大刺鰍全同胞家系17個(gè)。

1.2 家系管理

待每個(gè)家系的仔魚平游開口后，將其移至苗種培育池(3×667 m2土池)的6 m×1 m×1 m、40目篩絹網(wǎng)中培育，每天投喂豐年蟲、輪蟲及枝角類等生物餌料。培育30 d后轉(zhuǎn)喂水蚯蚓，此時(shí)每個(gè)網(wǎng)箱中懸掛一個(gè)30 cm×30 cm×15 cm餌料臺(tái)。前7 d將水蚯蚓均勻投放到網(wǎng)箱底部，待魚苗轉(zhuǎn)料成功后，慢慢將投喂范圍縮小，最終收至餌料臺(tái)中進(jìn)行集中投喂，為下一階段的轉(zhuǎn)料做準(zhǔn)備。當(dāng)魚苗長(zhǎng)至5～6 cm后進(jìn)行馴食轉(zhuǎn)人工配合飼料。轉(zhuǎn)料過程為水蚯蚓-水蚯蚓/粉料-粉料，大約需要15 d。人工配合飼料為粉料(鰻粉)，粗蛋白含量為43%～50%，水和粉料的比例為1.1∶1.0～1.2∶1.0。投喂量約占魚體質(zhì)量的3%～4%，投喂時(shí)間為早上8：00，下午16：00。當(dāng)魚苗培育至8～10 cm/尾時(shí)，將培育的網(wǎng)箱換成2.0 m×4.0 m×1.5 m、10目網(wǎng)箱，繼續(xù)培育至30～50 g/尾。

1.3 家系標(biāo)記及測(cè)量

經(jīng)過18個(gè)月的培育，10組家系個(gè)體經(jīng)歷了馴食轉(zhuǎn)料、苗種培育和成熟發(fā)育等階段。在魚苗達(dá)到30～50 g/尾后，注射PIT電子標(biāo)簽，將其從網(wǎng)箱中移出，放入同一口池塘進(jìn)行混養(yǎng)比較。待個(gè)體成熟后，將其起捕，掃碼稱重，隨機(jī)記錄每個(gè)家系30尾雄魚和雌魚的體質(zhì)量。同時(shí)統(tǒng)計(jì)每個(gè)家系的成活率，淘汰成活率低于30%的家系。最后保留了7個(gè)家系，分別用A～G標(biāo)注。

2 數(shù)據(jù)分析與計(jì)算

數(shù)據(jù)預(yù)處理和初步統(tǒng)計(jì)分析在SPSS 16.0軟件上完成，利用線性回歸(Linear regression)模塊的Casewise diagnostics項(xiàng)對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行奇異值檢測(cè)；并利用Descriptive statistics和Histogram模塊對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)、正態(tài)性檢驗(yàn)和頻率直方圖制作。為了滿足后續(xù)方差分析的要求，利用Transform模塊對(duì)偏離正態(tài)分布(Shapiro-Wilk，P<0.01)的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行自然對(duì)數(shù)(Ln)轉(zhuǎn)換并生成新變量。

利用ASReml 3.0軟件實(shí)現(xiàn)對(duì)育種值的估計(jì)，基于動(dòng)物模型(Animal model)進(jìn)行分析，采用限制性最大似然法(Restrictied maximum likelihood，REML)迭代運(yùn)算。分析育種值的數(shù)學(xué)模型如下：

Yij=μ+fi+ɑij+eij

(1)

公式(1)中，Yij為性狀觀測(cè)值；μ為總體平均值；fi為固定效應(yīng)(池塘和性別效應(yīng)等)；ɑij為個(gè)體加性效應(yīng)；eij為隨機(jī)殘差。

遺傳力(h2)計(jì)算公式：

(2)

遺傳力顯著性的t檢驗(yàn)為：

(3)

公式(3)中，Sh2為遺傳力的標(biāo)準(zhǔn)偏差，n為加性效應(yīng)的組數(shù)。

3 結(jié)果與分析

3.1 生長(zhǎng)性狀描述性統(tǒng)計(jì)

對(duì)不同全同胞家系個(gè)體的生長(zhǎng)性狀數(shù)據(jù)進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如表1所示。不同家系間平均體質(zhì)量具有明顯的差異，家系間體質(zhì)量的變異系數(shù)主要為15.1%～26.9%，只有F組達(dá)到了41.5%。結(jié)合偏度值、峰度值和正態(tài)檢驗(yàn)，對(duì)偏離正態(tài)分布的數(shù)據(jù)經(jīng)Ln轉(zhuǎn)換后生產(chǎn)新的變量(圖1～圖4)。從不同家系的平均體質(zhì)量分析，家系B的雄魚和雌魚體質(zhì)量均為最大，分別為(286.67±50.43)g/ind和(186.67±42.68)g/ind。家系F的雄魚和雌魚體質(zhì)量均為最小，分別為(158.63±65.84)g/ind和(73.47±17.58)g/ind。

表1 大刺鰍全同胞家系生長(zhǎng)性狀的描述性統(tǒng)計(jì)

3.2 不同家系育種值評(píng)估

利用ASReml軟件對(duì)個(gè)體的BLUP育種值進(jìn)行評(píng)估，分別選取育種值排名前50的雌魚和雄魚個(gè)體。如表2和表3所示，雌魚育種值前50的個(gè)體主要集中在家系B、E和D中，其中育種值前24名均為家系B個(gè)體，育種值范圍為38.45～67.49。雄魚育種值前50的個(gè)體主要集中在家系B、E和C中，其中育種值前19名均為家系B的個(gè)體，育種值范圍為48.81～75.09。

表2 育種值排名前50的大刺鰍雌魚

續(xù)表2

續(xù)表2

表3 育種值排名前50的大刺鰍雄魚

續(xù)表3

續(xù)表3

在水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種中，對(duì)遺傳力水平未有權(quán)威的劃分規(guī)則，參照家畜育種上的劃分原則，將h2<0.15劃分為低遺傳力，0.150.30劃分為高遺傳力。本研究檢測(cè)的18月齡大刺鰍體質(zhì)量的方差組分評(píng)估結(jié)果如表4所示，遺傳力達(dá)到了(0.468 1±0.173 7)，屬于高遺傳力。經(jīng)t檢驗(yàn)，結(jié)果如表5所示，全同胞家系的遺傳力估值具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，體質(zhì)量達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，說明參數(shù)估值準(zhǔn)確度較高，在實(shí)際育種過程中可作為參考。

表4 大刺鰍18月齡體質(zhì)量的方差組分估計(jì)結(jié)果

表5 遺傳力評(píng)估值的t檢驗(yàn)結(jié)果

在對(duì)雌、雄進(jìn)行分開統(tǒng)計(jì)的情況下，表型值和育種值相關(guān)性極高。如圖5和圖6所示，雄魚的育種值和體質(zhì)量之間成線性關(guān)系，回歸方程為y=0.393 6x-84.193 0(R2=0.755 4，P<0.01)，雌魚的育種值和體質(zhì)量之間也呈線性關(guān)系，回歸方程為y=0.517x-64.126(R2=0.817 8，P<0.01)。因此，在選育過程中利用表型值或BLUP育種值的選擇過程中均需考慮性別因素的影響。

4 討論

水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種一直是我國(guó)漁業(yè)產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重點(diǎn)工作，經(jīng)過幾十年的努力，目前通過國(guó)家原良種委員會(huì)審定的新品種有200多種，為我國(guó)漁業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展作出了重要貢獻(xiàn)。家系選育技術(shù)由于其系譜清晰、可延緩近交衰退、縮短育種年限、選育效果好并可為分子育種奠定基礎(chǔ)等優(yōu)勢(shì)，是目前水產(chǎn)品獲得優(yōu)良品系的重要方式之一。家系選育技術(shù)結(jié)合BLUP育種值和遺傳力評(píng)估方法，可實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)育種，大大提升育種效率。例如Neira R等[22]采用BLUP開展了4代銀大馬哈魚的人工選育工作，平均每代的體質(zhì)量增加了13.9%；Gall G A E等[28]采用BLUP對(duì)羅非魚進(jìn)行連續(xù)3代選育，與群體選育相比，選育系平均體質(zhì)量增加40.0%。我國(guó)在鯉和草魚的育種實(shí)踐中，基于BLUP育種值的家系選育也取得了較大的進(jìn)展[29-30]。

本文利用人工繁殖方法構(gòu)建大刺鰍全同胞家系選育的基礎(chǔ)群體(F0)，在經(jīng)過18個(gè)月的培育后，獲得7個(gè)有效家系的雌魚和雄魚的體質(zhì)量數(shù)據(jù)。采用單性狀動(dòng)物模型，以各家系個(gè)體的體質(zhì)量為協(xié)變量，通過BLUP估算每個(gè)個(gè)體的育種值和遺傳力。結(jié)果表明，體質(zhì)量與育種值之間呈線型關(guān)系，體質(zhì)量與育種值呈正相關(guān)，雄魚回歸方程為y=0.393 6x-84.193 0(R2=0.755 4)；雌魚回歸方程為y= 0.517x-64.126(R2=0.817 8)。育種值前50的雌性個(gè)體主要集中在家系B、E和D中，尤其是家系B，雌性育種值前23和雄性育種值前19均為該家系個(gè)體。本文的分析結(jié)果顯示18月齡大刺鰍全同胞家系的體質(zhì)量遺傳力較高，達(dá)到了(0.468 1±0.173 7)，t檢驗(yàn)P<0.01。這與朱文彬等[31]研究結(jié)果相近，30日齡鳙魚體質(zhì)量和體長(zhǎng)的遺傳力估值分別為0.47和0.49，且均達(dá)到極顯著水平。傅建軍等[32]研究也發(fā)現(xiàn)4月齡草魚幼魚的體質(zhì)量和全長(zhǎng)的遺傳力分別為(0.34±0.15)和(0.33±0.13)，且二者與遺傳力呈極顯著正相關(guān)。以上結(jié)果說明了數(shù)量性狀在很多魚類中出現(xiàn)了較高的遺傳力，但是在鯉[29]、羅非魚[33]和鱘魚[34]等部分魚類中則出現(xiàn)了相反的結(jié)果。造成遺傳力估值差異的因素有養(yǎng)殖環(huán)境、分析模型和數(shù)量性狀的采集時(shí)間等。因此，在家系選育及遺傳力評(píng)估工作中應(yīng)重視統(tǒng)計(jì)分析模型的選擇，采用動(dòng)物模型和REML運(yùn)算可以降低遺傳參數(shù)估計(jì)造成的偏差，同時(shí)應(yīng)保持養(yǎng)殖環(huán)境條件穩(wěn)定，統(tǒng)一樣品采集時(shí)間節(jié)點(diǎn)，可提升遺傳力評(píng)估準(zhǔn)確性。此外，在后續(xù)制定育種方案時(shí)有必要構(gòu)建更多的家系，并在逐代個(gè)體選擇過程中兼顧個(gè)體的家系來源，避免近交水平的積累。

5 結(jié)論

體質(zhì)量作為大刺鰍的家系選育主要形態(tài)學(xué)指標(biāo)與性別具有明顯的相關(guān)性，因此在今后的育種中應(yīng)考慮性別的因素。從本研究的分析結(jié)果看，雌雄育種值最高的個(gè)體均出現(xiàn)在全同胞家系B中，PIT-900111881517645雄魚育種值最高，為75.09，PIT-900111881517648雌魚育種值最高，為67.49；其次，全同胞家系E中PIT-900219000981542雄魚育種值最高，為47.51，PIT-900219000981477雌魚育種值最高，為37.47。以上2個(gè)家系育種值較靠前的個(gè)體，可作為下一代繁育的主要親本，進(jìn)行跨家系自由組合配對(duì)，提升下一代大刺鰍個(gè)體的生長(zhǎng)性能。