李小梅，李麗珍，何春慧，張麗姬，王河丹，吳學(xué)貴

（海南威爾檢測(cè)技術(shù)有限公司，海南澄邁 571924）

抗生素類(lèi)種類(lèi)繁多，在人們的防治感染性疾病和動(dòng)物的抗菌促生長(zhǎng)等方面應(yīng)用較廣。抗生素濫用或過(guò)度使用會(huì)導(dǎo)致人和動(dòng)物對(duì)其產(chǎn)生耐藥性[1]。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，抗生素的作用主要是預(yù)防和治療疾病，提高水產(chǎn)動(dòng)物的存活率[2]。因此，在全球的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中，抗生素被大量使用，對(duì)人體健康造成一定危害[3]。本文建立了固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[4]檢測(cè)淡水養(yǎng)殖用水中的25種抗生素類(lèi)殘留檢測(cè)，為檢測(cè)淡水養(yǎng)殖用水中磺胺類(lèi)和喹諾酮類(lèi)抗生素殘留提供可靠的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、培氟沙星、沙拉沙星、洛美沙星、氟甲喹、丹諾沙星、雙氟沙星、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺異惡唑、磺胺甲嘧啶、磺胺吡啶、磺胺噻唑、磺胺嘧啶、磺胺醋酰、磺胺多辛、磺胺甲惡唑、磺胺氯噠嗪、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺甲二唑、磺胺二甲嘧啶和甲氧芐啶標(biāo)準(zhǔn)品（純度均≥97.00%，Dr.Ehrenstorfer GmbH公司）；鹽酸（優(yōu)級(jí)純，廣州牌化學(xué)試劑）；甲醇、乙腈（色譜純，北京百靈威科技有限公司）；乙二胺四乙酸二鈉（分析純，廣東光華科技股份有限公司）；Oasis HLB小柱（Waters公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent1290/G6470A超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（美國(guó)Agilent Technologies公司）；AB204-S電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；TTLDCII氮吹儀（北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理

取500 mL過(guò)濾后的淡水養(yǎng)殖用水水樣用鹽酸溶液酸化后，加入乙二胺四乙酸二鈉200 mg，混勻后過(guò)HBL小柱凈化、提取，用12 mL甲醇洗脫，洗脫液吹至近干，加入1 mL流動(dòng)相（0.5 mmol乙酸銨-0.1%甲酸溶液∶乙腈=9∶1），混勻后過(guò)濾膜，濾液供超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀分析。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱(chēng)取25種抗生素固體標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg，加入適量甲醇超聲溶解，配制成質(zhì)量濃度為10 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，待用。移取適量10 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，用甲醇稀釋成0.1 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)中間液。用流動(dòng)相（0.5 mmol乙酸銨 -0.1% 甲酸溶液∶乙腈 = 9 ∶ 1）稀釋標(biāo)準(zhǔn)中間液，分別配制成質(zhì)量濃度為 0.1 ng/L、0.5 ng/L、1.0 ng/L、2.0 ng/L、5.0 ng/L、10.0 ng/L、25.0 ng/L和50.0 ng/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.3 儀器條件

（1）色譜條件。色譜柱：Poroshell 120 EC-C18（50 mm×2.1 mm，2.7 μm）；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：2 μL；流動(dòng)相A為0.5 mmol乙酸銨-0.1%甲酸溶液，流動(dòng)相B為乙腈；梯度洗脫：0 min，95%A，3.5 min時(shí)，88%A，4.0 min時(shí)，86%A，7.0 min時(shí)，63%A，7.1 min時(shí)，5%A，8.7 min時(shí)，5%A，8.8 min時(shí)，95%A；流速：0.3 mL/min。

（2）質(zhì)譜條件。離子源為電噴霧離子源AJS ESI，正離子模式；毛細(xì)管電壓：4000 V；離子源溫度：300 ℃；鞘氣溫度：350 ℃；檢測(cè)方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理?xiàng)l件優(yōu)化

參考2008年農(nóng)業(yè)部發(fā)布的《水產(chǎn)品中17種磺胺類(lèi)及15種喹諾酮類(lèi)藥物殘留量的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》[5]磺胺類(lèi)和喹諾酮類(lèi)檢測(cè)方法，本文用鹽酸溶液和氨水調(diào)節(jié)水樣pH為酸性2.5、弱酸性5.2和近中性7.7，研究水質(zhì)酸堿度對(duì)回收率的影響，每個(gè)樣品在不同pH條件下平行加標(biāo)6個(gè)，濃度為 10 ng/L，結(jié)果見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)表明pH為2.5時(shí)，平均回收率較高且相對(duì)穩(wěn)定。因此，本文選擇將淡水養(yǎng)殖用水pH調(diào)節(jié)為2.5進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

表1 不同pH條件下藥物的平均回收率及RSD（單位：%）

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

按照優(yōu)化后的條件和方法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行分析測(cè)定，以目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)x、峰面積為縱坐標(biāo)y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。25種抗生素藥物的線性關(guān)系見(jiàn)表2，相關(guān)系數(shù)為0.99061～0.99983。

表2 抗生素藥物的線性方程

2.3 方法檢出限

用陰性樣品加標(biāo)處理，用流動(dòng)相稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以信噪比（S/N）=3為方法檢出限。如圖1所示，淡水養(yǎng)殖用水中磺胺嘧啶、磺胺甲嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、氧氟沙星和環(huán)丙沙星5種抗生素檢出限為 0.1 ng/L，磺胺甲惡唑、恩諾沙星、丹諾沙星和氟甲喹4種抗生素檢出限為0.2 ng/L，甲氧芐啶、磺胺氯噠嗪、磺胺多辛、磺胺醋酰、磺胺吡啶、雙氟沙星、洛美沙星和培氟沙星8種抗生素檢出限為0.5 ng/L，磺胺二甲嘧啶、磺胺甲二唑、磺胺甲氧噠嗪、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺噻唑、磺胺異惡唑、諾氟沙星和沙拉沙星8種抗生素的檢出限為1.0 ng/L。因此，該方法的檢測(cè)靈敏度較高。

圖1 淡水養(yǎng)殖用水中25種抗生素檢出限

2.4 回收率與精密度實(shí)驗(yàn)

本文選擇將淡水養(yǎng)殖用水pH調(diào)節(jié)為2.5進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，采用加標(biāo)回收法進(jìn)行回收率和精密度實(shí)驗(yàn)，分別計(jì)算出的磺胺類(lèi)藥物平均回收率為100.7%～115.4%，RSD為1.05%～4.69%，喹諾酮類(lèi)藥物平均回收率為90.1%～111.0%，RSD為2.20%～9.55%，各項(xiàng)指標(biāo)均符合要求。

2.5 樣品檢測(cè)

按照優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)條件對(duì)4處淡水養(yǎng)殖用水中25種抗生素進(jìn)行檢測(cè)。如圖2所示，淡水養(yǎng)殖用水中25種抗生素在8 min內(nèi)全部出峰，出峰時(shí)間較快，提高了檢測(cè)效率。

圖2 淡水養(yǎng)殖用水中25種抗生素出峰時(shí)間

3 結(jié)論

本文建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)淡水養(yǎng)殖用水中25種抗生素進(jìn)行檢測(cè)，該方法25種抗生素出峰時(shí)間快，檢出限為0.1～1.0 ng/L，相關(guān)系數(shù)為0.99061～0.99983，磺胺類(lèi)藥物平均回收率為100.7%～115.4%，RSD為1.05%～4.69%，喹諾酮類(lèi)藥物平均回收率為90.1%～111.0%，RSD為2.20%～9.55%。該方法快速、穩(wěn)定、靈敏度和準(zhǔn)確度高，適用于淡水養(yǎng)殖用水中磺胺類(lèi)和喹諾酮類(lèi)藥物檢測(cè)。