常明智，張思雨，郝艷嬌，張森露，張曉麗*（.河北北方學(xué)院，河北 張家口 075000；.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003）

食管癌是常見(jiàn)的消化道腫瘤，國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)統(tǒng)計(jì)的“2018年全球癌癥發(fā)病率和病死率”數(shù)據(jù)顯示，在全球惡性腫瘤中食管癌的發(fā)病率和病死率分別位居第七位和第六位[1-2]。臨床治療食管癌主要以局部放療和全身化療為主，但由于食管癌早期癥狀隱匿，患者就診時(shí)多已發(fā)展至中晚期，導(dǎo)致療效欠佳且毒副作用明顯，嚴(yán)重影響患者預(yù)后。因此尋找療效明顯、副作用小的抗食管癌藥物成了亟需解決的問(wèn)題之一。黃芪是我國(guó)傳統(tǒng)的補(bǔ)氣中藥之一，含有多種化學(xué)成分，具有增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤、抗衰老等作用。黃芪多糖是黃芪的主要有效成分之一，相關(guān)研究證實(shí)了黃芪多糖對(duì)多種腫瘤細(xì)胞都有抑制作用[3-4]。

自噬是在自噬相關(guān)基因的調(diào)控下溶酶體自我降解代謝的過(guò)程，是包括腫瘤發(fā)生、發(fā)展、細(xì)胞死亡和存活在內(nèi)的各種生理病理過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵機(jī)制[5-6]。自噬被證明與凋亡有復(fù)雜的關(guān)系，特別是在腫瘤細(xì)胞系中。正常情況下，自噬在細(xì)胞生長(zhǎng)，發(fā)育和穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，是一種依賴溶酶體對(duì)異常的細(xì)胞器和蛋白質(zhì)等物質(zhì)進(jìn)行降解的過(guò)程，然而，當(dāng)自噬持續(xù)發(fā)生時(shí)，會(huì)引起細(xì)胞非程序性死亡從而抑制細(xì)胞的增殖[7]。自噬在抗腫瘤作用機(jī)制中具有重要意義，但是黃芪多糖抗食管癌的作用機(jī)制是否與影響細(xì)胞自噬水平有關(guān)仍待探索。

本課題組擬通過(guò)體外培養(yǎng)食管癌EC109細(xì)胞，探討黃芪多糖能否通過(guò)調(diào)控食管癌EC109細(xì)胞自噬水平進(jìn)而影響EC109細(xì)胞的生物學(xué)行為。

1 材料

1.1 細(xì)胞

食管癌EC109細(xì)胞系（中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)）。

1.2 試藥

注射用黃芪多糖（批號(hào)：210202，天津賽諾制藥有限公司，每瓶含黃芪多糖250 mg）。噻唑藍(lán)（MTT）試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒（北京索萊寶有限公司）；DMEM高糖培養(yǎng)基（美國(guó)CORNING公司）；胎牛血清（美國(guó)Gegrogen公司）；胰蛋白酶（南京凱基生物科技有限公司）；微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3B抗體）和人死骨片1（P62抗體）（美國(guó)CST公司）；自噬效應(yīng)蛋白Beclin1（Abcam公司）；自噬抑制劑PIK-Ⅲ（Selleck公司）。

1.3 儀器

S-3400N掃描電鏡和冷凍干燥機(jī)（日本日立公司）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）；二氧化碳恒溫孵化器（美國(guó)熱電公司）；電泳儀（北京六一儀器廠）；超靈敏多功能成像儀600（美國(guó)GE公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

復(fù)蘇后的EC109細(xì)胞用DMEM高糖培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、青霉素100 U·mL-1、鏈霉素100 μg·mL-1）培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)液每24 h更換一次，待細(xì)胞融合至80%以上后傳代，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 黃芪多糖對(duì)EC109細(xì)胞增殖活性的影響

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EC109細(xì)胞用0.25%的胰蛋白酶消化后制成細(xì)胞懸液，以每孔4×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后棄掉原培養(yǎng)液，加藥，設(shè)對(duì)照組（0 mg·mL-1）、黃芪多糖藥物組（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg·mL-1），每組設(shè)立6個(gè)復(fù)孔，邊緣孔內(nèi)各加入100 μL PBS，繼續(xù)于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后每孔加入20 μL MTT（質(zhì)量濃度為5 mg·mL-1），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄去培養(yǎng)液，每孔加入100 μL的二甲基亞砜（DMSO），避光搖床輕微振蕩10 min，使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)波長(zhǎng)490 nm處的各孔的細(xì)胞光密度值（OD值），并對(duì)各組的OD值進(jìn)行比較，計(jì)算其抑制率：細(xì)胞抑制率（%）＝（1-OD實(shí)驗(yàn)組/OD對(duì)照組）×100%，篩選出低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度（1.0、1.5、2.0 mg·mL-1）的黃芪多糖進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 黃芪多糖抑制EC109細(xì)胞增殖與細(xì)胞自噬的關(guān)系

按照“2.2”項(xiàng)下結(jié)果，將細(xì)胞分為對(duì)照組、高濃度黃芪多糖組（2.0 mg·mL-1）、高濃度黃芪多糖（2.0 mg·mL-1）聯(lián) 合5 μmol·L-1PIK-Ⅲ（自噬抑制劑）組、自噬抑制劑組。其他步驟同“2.2”項(xiàng)下。

2.4 吖啶橙染色實(shí)驗(yàn)觀察黃芪多糖對(duì)EC109細(xì)胞凋亡的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EC109細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，以每孔2×105個(gè)細(xì)胞接種于鋪好爬片的24孔板中，于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待其貼壁后，吸棄培養(yǎng)基，PBS洗2遍，每次5 min，分別用不同濃度的黃芪多糖進(jìn)行處理，繼續(xù)于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸棄培養(yǎng)基，PBS洗2遍，晾干，95%乙醇溶液固定5 min，滴加0.01%（1 μg·mL-1）吖啶橙染液染色5 min，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 min，小心取出爬片，PBS沖洗2遍，滴加防淬滅封片液，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)黃芪多糖對(duì)EC109細(xì)胞凋亡的影響

消化、離心并收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EC109細(xì)胞接種于6孔板，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度為4×105個(gè)·mL-1，24 h后棄培養(yǎng)液，加藥，設(shè)置對(duì)照組，低、中、高濃度（1.0、1.5、2.0 mg·mL-1）黃芪多糖組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后棄培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，無(wú)EDTA胰酶消化后離心，收集細(xì)胞，加入500 μL 1×Binding Buffer制備成細(xì)胞懸液，再加入5 μL PI和5 μL Annexin V-FITC后避光孵育15 min，冰上放置，于1 h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)，F(xiàn)ACS Diva 4.1軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

2.6 黃芪多糖對(duì)EC109細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)的影響

準(zhǔn)備無(wú)菌圓形小蓋玻片，于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞，制成4×104個(gè)·mL-1的EC109細(xì)胞懸液，24孔板細(xì)胞爬片，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取出，用PBS緩沖液清洗3次（貼孔壁緩慢加入，避免細(xì)胞被沖掉），使用2.5%戊二醛固定樣本，于4℃冰箱放置4～6 h，PBS洗3次（每次5 min），乙醇（30%、50%、70%、75%、80%、85%、95%、100%）梯度脫水（每次5 min），叔丁醇置換2次（每次10 min），第二次叔丁醇不吸出，放入冷凍干燥儀中過(guò)夜，次日用離子濺射儀噴鍍，掃描電子顯微鏡觀察細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)。

2.7 黃芪多糖對(duì)EC109細(xì)胞垂直遷移的影響

將處在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)的EC109細(xì)胞饑餓處理12 h，24孔板內(nèi)加入500 μL含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，將Transwell小室放入加了培養(yǎng)基的孔里，然后將上述饑餓處理過(guò)的EC109細(xì)胞用0.25%的胰蛋白酶進(jìn)行消化，離心，PBS重懸細(xì)胞，每組細(xì)胞數(shù)為4.0×104個(gè)·mL-1，調(diào)整黃芪多糖的濃度為1.0、1.5、2.0 mg·mL-1，用其再次將細(xì)胞重懸，24孔板每孔加200 μL的EC109細(xì)胞懸液，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出24孔板，使用移液槍吸出小室中的廢液，擦去小室壁上未遷移的細(xì)胞，風(fēng)干，用4%多聚甲醛固定15～20 min，取出小室，再次風(fēng)干，結(jié)晶紫染色15～20 min，PBS清洗3次，倒置顯微鏡下觀察，拍照留存。

2.8 黃芪多糖對(duì)EC109細(xì)胞侵襲能力的影響

將-20℃ Matrigel膠（基質(zhì)膠）于4℃解凍過(guò)夜，次日，用無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋Matrigel膠（基質(zhì)膠∶無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基＝1∶4），取出4個(gè)Transwell小室，每個(gè)小室內(nèi)均勻加入60 μL已稀釋的Matrigel膠，置于培養(yǎng)箱中4 h至Matrigel膠凝固，其他步驟同“2.7”項(xiàng)下。

2.9 黃芪多糖對(duì)LC3的熒光表達(dá)強(qiáng)度的影響

將食管癌EC109細(xì)胞按照對(duì)照組，低、中、高濃度黃芪多糖藥物組分別接種到共聚焦小皿中孵育24 h，加藥處理，藥物作用24 h后用PBS緩沖液沖洗細(xì)胞2次，每次5 min，然后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min，再用適量0.1% Triton X-100孵育10 min，1% BSA封閉30 min，最后在含有一抗LC3（1∶200）中4℃孵育過(guò)夜。孵育完成后用PBS緩沖液洗滌3次，每次5 min，室溫避光孵育對(duì)應(yīng)二抗1 h（1∶200），用PBS洗滌3次，每次5 min，DAPI室溫避光染色5 min，PBS洗滌3次，每次5 min，雙蒸水洗滌1次，滴加防淬滅封片劑進(jìn)行避光封片，激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行成像觀察。

2.10 黃芪多糖對(duì)自噬相關(guān)蛋白Beclin1、P62和LC3B表達(dá)水平的影響

不同濃度黃芪多糖處理EC109細(xì)胞24 h后，收集各組細(xì)胞，按照100 μL RIPA（細(xì)胞裂解液）∶1 μL PMSF（蛋白酶抑制劑）∶2 μL NAF（磷酸酶抑制劑）比例提取細(xì)胞全蛋白，BCA蛋白定量試劑盒對(duì)蛋白濃度進(jìn)行定量，制備分離膠和濃縮膠（LC3B抗體用15%分離膠和濃縮膠，其余抗體用10%分離膠和濃縮膠），煮蛋白10 min，加樣，電泳（電壓90 V，電流300 mA，30 min后電壓轉(zhuǎn)120 V，電流不變，1 h），轉(zhuǎn)膜（電壓100 V，電流恒流250 mA，1 h），轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，室溫下用5%的脫脂牛奶（脫脂奶粉∶1×TBST＝1∶20）封閉PVDF膜1 h，一抗（Beclin1、LC3B、P62）用5%的脫脂牛奶稀釋（根據(jù)抗體說(shuō)明書(shū)）后孵育，4℃過(guò)夜；復(fù)溫后回收一抗，用1×TBST洗膜3次，每次10 min，二抗室溫下孵育2 h，再用1× TBST洗膜3次，每次10 min，顯色液顯色，Amersham Imager 600顯影，使用Image J軟件分析灰度值。

2.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以（±s）表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間數(shù)據(jù)兩兩比較采用t檢驗(yàn)，使用GraphPad Prism軟件進(jìn)行繪圖，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 黃芪多糖抑制EC109細(xì)胞增殖

MTT結(jié)果顯示，隨著黃芪多糖濃度升高，其對(duì)EC109細(xì)胞的抑制率也越來(lái)越高，表明黃芪多糖可以以劑量依賴性方式抑制EC109細(xì)胞增殖。與對(duì)照組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。篩選出抑制率分別為28%、45%、56%的低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度（1.0、1.5、2.0 mg·mL-1）的黃芪多糖進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)（見(jiàn)表1）。

表1 黃芪多糖對(duì)EC109細(xì)胞增殖的影響(±s) Tab 1 Effect of APS on the proliferation of EC109 cells (±s)

表1 黃芪多糖對(duì)EC109細(xì)胞增殖的影響(±s) Tab 1 Effect of APS on the proliferation of EC109 cells (±s)

注（Note）：與對(duì)照組（0 mg·mL-1）相比，**P＜0.01（Compared with the control group，**P＜0.01）。

黃芪多糖藥物濃度/（mg·mL-1） OD值 抑制率/%0 0.947±0.02 0 0.5 0.742±0.03** 21 1.0 0.676±0.01** 28 1.5 0.514±0.02** 45 2.0 0.411±0.03** 56 2.5 0.332±0.04** 64 3.0 0.253±0.02** 73

3.2 黃芪多糖可能通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬抑制EC109細(xì)胞增殖

MTT結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，高濃度黃芪多糖組、高濃度黃芪多糖聯(lián)合自噬抑制劑組、自噬抑制劑組的細(xì)胞抑制率逐漸降低（P＜0.01），表明黃芪多糖可能通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬進(jìn)而抑制EC109細(xì)胞增殖（見(jiàn)表2）。

表2 黃芪多糖、自噬抑制劑對(duì)EC109細(xì)胞增殖的影響(±s) Tab 2 Effect of APS and autophagy inhibitor on the proliferation of EC109 cells (±s)

表2 黃芪多糖、自噬抑制劑對(duì)EC109細(xì)胞增殖的影響(±s) Tab 2 Effect of APS and autophagy inhibitor on the proliferation of EC109 cells (±s)

注（Note）：與對(duì)照組相比，**P＜0.01（Compared with the control group，**P＜0.01）。

組別 OD值 抑制率/%對(duì)照組 0.771±0.02 0高濃度黃芪多糖組 0.377±0.02** 51高濃度黃芪多糖＋自噬抑制劑組 0.433±0.01** 44自噬抑制劑組 0.584±0.03** 24

3.3 黃芪多糖促進(jìn)EC109細(xì)胞凋亡

吖啶橙染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組活細(xì)胞核內(nèi)多呈彌散均勻熒光，隨著用藥濃度的增加，細(xì)胞核內(nèi)濃染致密的顆粒塊狀熒光逐漸增多，表明黃芪多糖可以促進(jìn)EC109細(xì)胞凋亡產(chǎn)生程序性的核固縮現(xiàn)象（見(jiàn)圖1）。

圖1 吖啶橙染色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)黃芪多糖組細(xì)胞的凋亡程度Fig 1 Degree of apoptosis of EC109 cells determined by acridine orange staining assay in the APS groups

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，以凋亡早期（Q4）和晚期凋亡（Q2）之和為總的凋亡細(xì)胞數(shù)，其細(xì)胞凋亡率隨著用藥濃度的增加呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)，對(duì)照組，低、中、高濃度黃芪多糖組的細(xì)胞凋亡率分別為：（11.8±0.44）%、（15.9±0.37）%、（28.3±0.41）%、（41.0±0.48）%（見(jiàn)圖2）。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)黃芪多糖組細(xì)胞的凋亡程度Fig 2 Degree of apoptosis of EC109 cells determined by flow cytometry in the APS groups

3.4 黃芪多糖破壞EC109細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)

對(duì)照組的EC109細(xì)胞可以觀察到細(xì)胞呈三維立體橢圓形結(jié)構(gòu)，細(xì)胞整體形態(tài)豐滿，表面可見(jiàn)豐富的微絨毛和偽足，且偽足與其他細(xì)胞表面的偽足相互連接（見(jiàn)圖3A）；低濃度黃芪多糖組可見(jiàn)細(xì)胞的整體形態(tài)變化與對(duì)照組相比不太明顯，但細(xì)胞表面的微絨毛和偽足相對(duì)減少且形態(tài)上變得更加短?。ㄒ?jiàn)圖3B）；中濃度黃芪多糖組觀察到細(xì)胞整體形態(tài)呈不規(guī)則型改變，細(xì)胞膜發(fā)生輕微的皺縮，細(xì)胞表面微絨毛和偽足進(jìn)一步減少（見(jiàn)圖3C）；高濃度黃芪多糖組可見(jiàn)細(xì)胞膜皺縮明顯，細(xì)胞表面觀察不到明顯的微絨毛和偽足的存在（見(jiàn)圖3D）。可見(jiàn)，隨著黃芪多糖濃度的增加，食管癌EC109細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)的破壞愈發(fā)嚴(yán)重，表明黃芪多糖可能通過(guò)破壞EC109細(xì)胞的表面結(jié)構(gòu)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)進(jìn)而抑制其增殖。

圖3 黃芪多糖對(duì)EC109細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)的影響（×3000）Fig 3 Effect of APS on the surface structure of EC109 cells（×3000）

3.5 黃芪多糖抑制EC109細(xì)胞遷移能力

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黃芪多糖能顯著抑制EC109細(xì)胞的遷移能力（見(jiàn)圖4）。隨著黃芪多糖濃度的增加，EC109細(xì)胞穿膜數(shù)逐漸減少，對(duì)照組，低、中、高濃度黃芪多糖組遷移細(xì)胞數(shù)依次是（152±4）、（98±6）、（84±2）、（20±5）。與對(duì)照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖4 黃芪多糖對(duì)EC109細(xì)胞的遷移能力的影響Fig 4 Effect of APS on the migration capacity of EC109 cells

3.6 黃芪多糖抑制EC109細(xì)胞侵襲能力

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黃芪多糖能顯著抑制EC109細(xì)胞的侵襲能力（見(jiàn)圖5）。隨著黃芪多糖濃度的遞增，EC109細(xì)胞穿膠數(shù)逐漸減少。對(duì)照組，低、中、高濃度黃芪多糖組侵襲細(xì)胞數(shù)依次是（109±3）、（68±5）、（53±4）、（17±6）。與對(duì)照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖5 黃芪多糖對(duì)EC109細(xì)胞的侵襲能力的影響Fig 5 Effect of APS on the invasion capacity of EC109 cells

3.7 黃芪多糖誘導(dǎo)LC3熒光表達(dá)強(qiáng)度增強(qiáng)

如圖6所示，對(duì)照組細(xì)胞LC3熒光強(qiáng)度較弱，各給藥組細(xì)胞LC3熒光染色強(qiáng)度較對(duì)照組升高。表明黃芪多糖可能通過(guò)誘導(dǎo)LC3蛋白的表達(dá)增強(qiáng)進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞自噬水平增高。對(duì)照組，低、中、高濃度黃芪多糖組LC3的相對(duì)熒光強(qiáng)度表達(dá)依次為（0.05±0.01）、（0.11±0.02）、（0.24±0.04）、（0.52±0.02）。與對(duì)照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖6 黃芪多糖誘導(dǎo)LC3熒光表達(dá)強(qiáng)度增強(qiáng)Fig 6 APS induced an enhanced fluorescence expression intensity of LC3

3.8 黃芪多糖誘導(dǎo)EC109細(xì)胞發(fā)生自噬

Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，各給藥組P62蛋白表達(dá)逐漸下調(diào)（P＜0.01），Beclin1、LC3B蛋白表達(dá)逐漸上調(diào)（P＜0.05，P＜0.01），表明黃芪多糖可以誘導(dǎo)EC109細(xì)胞發(fā)生自噬（見(jiàn)圖7）。

圖7 黃芪多糖對(duì)EC109細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的影響Fig 7 Effect of APS on autophagy-related proteins in EC109 cells

4 討論

食管癌是消化系統(tǒng)腫瘤中侵襲性極強(qiáng)的惡性腫瘤之一，食管癌細(xì)胞的快速增殖以及其極強(qiáng)的侵襲能力是導(dǎo)致患者病死率高的重要原因[8]。臨床放化療治療食管癌的毒副作用較強(qiáng)，患者的生存質(zhì)量較差，因此研究藥效溫和，副作用少且可抑制其細(xì)胞增殖及侵襲能力的藥物具有一定的意義。傳統(tǒng)中藥因靶點(diǎn)多、毒性低、療效佳，已成為抗腫瘤藥物研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)話題。作為黃芪最主要的有效成分之一，黃芪多糖藥效溫和，毒副作用較小，且已被證實(shí)在諸多腫瘤治療中有效，并與細(xì)胞自噬關(guān)系密切[9-11]。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，隨著黃芪多糖濃度的升高，食管癌EC109細(xì)胞增殖率遠(yuǎn)低于對(duì)照組。通過(guò)掃描電鏡觀察其表面結(jié)構(gòu)的變化，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表面微絨毛和偽足均少于對(duì)照組，且細(xì)胞膜也發(fā)生了皺縮。經(jīng)吖啶橙染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖可以使食管癌EC109細(xì)胞發(fā)生明顯的核固縮現(xiàn)象，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果證明了黃芪多糖可誘導(dǎo)EC109細(xì)胞凋亡。LC3熒光強(qiáng)度表達(dá)以及免疫蛋白印跡實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了黃芪多糖可誘導(dǎo)食管癌EC109細(xì)胞自噬水平增強(qiáng)。這表示黃芪多糖對(duì)于食管癌的治療具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。

細(xì)胞自噬調(diào)控作為一種有效的腫瘤治療干預(yù)策略越來(lái)越受到醫(yī)藥工作者的關(guān)注。自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin1和P62是自噬體形成必不可少的分子，在自噬體形成的不同階段均有LC3、Beclin1和P62的參與，是檢測(cè)自噬水平的三種標(biāo)記蛋白。LC3分為L(zhǎng)C3A、LC3B和LC3C三種亞型，其中LC3B亞型與自噬關(guān)系最為密切[12]，LC3參與自噬體形成到成熟的各個(gè)階段，當(dāng)自噬發(fā)生時(shí)，LC3-Ⅰ被活化，結(jié)合磷脂酰乙醇胺轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)C3-Ⅱ，促進(jìn)自噬體形成及成熟[13]，LC3-Ⅱ的變化水平與自噬程度成正相關(guān)，故自噬水平的高低可以通過(guò)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值大小進(jìn)行判斷[14]。Beclin1作為參與自噬體形成的一個(gè)必需分子，通過(guò)對(duì)自噬的調(diào)節(jié)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[15]，在自噬過(guò)程中Beclin1的表達(dá)水平往往會(huì)升高。而在自噬過(guò)程中，P62蛋白會(huì)在細(xì)胞質(zhì)中不斷地被降解，如果自噬被抑制，P62蛋白將會(huì)在細(xì)胞質(zhì)中不斷地積累，因此P62也可作為反映自噬水平的一種標(biāo)記蛋白[16]。有研究證實(shí)在諸多癌癥中檢測(cè)到P62的異常積聚[17-19]，提示P62的積聚與腫瘤的進(jìn)展有關(guān)，自噬通過(guò)限制P62的積聚而抑制腫瘤的發(fā)生[20]。本研究證實(shí)黃芪多糖可以通過(guò)上調(diào)自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin1，同時(shí)下調(diào)P62蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬水平增高，表明黃芪多糖對(duì)食管癌細(xì)胞的影響機(jī)制與其誘導(dǎo)發(fā)生細(xì)胞自噬有關(guān)。

綜上所述，黃芪多糖作為一種具有抗腫瘤作用的中藥，在抑制食管癌EC109細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)凋亡方面具有重要意義，其發(fā)揮抗腫瘤作用的機(jī)制與誘導(dǎo)細(xì)胞自噬水平增強(qiáng)有關(guān)。生物體內(nèi)自噬與病理生理的關(guān)系復(fù)雜，本課題僅論證了黃芪多糖可以通過(guò)調(diào)控其自噬相關(guān)蛋白誘導(dǎo)食管癌EC109細(xì)胞自噬水平增強(qiáng)，但其具體機(jī)制仍待進(jìn)一步探索。