王莉博，劉澤干，雷攀，黃小鳳，王淑惠，杜士明＊（.湖北醫(yī)藥學院藥學院，湖北 十堰 44000；.湖北醫(yī)藥學院附屬太和醫(yī)院，湖北 十堰 44000；3.武當特色中藥研究湖北省重點實驗室，湖北醫(yī)藥學院，湖北 十堰 44000）

機體發(fā)熱主要是由于外源性致熱原進入機體，刺激巨噬細胞等產生致熱性細胞因子，并可直接或間接作用于腦組織中前列腺素受體（EP3），引起發(fā)熱介質釋放[1-3]，體溫定調點上移，體溫升高。目前臨床常用非甾體抗炎藥，其大劑量使用會引起心血管系統(tǒng)、肝臟、中樞神經系統(tǒng)損害等不良反應[4]。中藥治療外感發(fā)熱以解表癥為主，外感風熱宜用辛涼解表藥，如柴胡、薄荷等；外感風寒宜用辛溫解表藥，如防風、麻黃等[5]。亦有文獻報道中藥的解熱作用機制與降低血清中白細胞介素1β（IL-1β）、白細胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平和下丘腦中環(huán)磷酸腺苷（cAMP）、精氨加壓素（AVP）和前列腺素E2（PGE2）等含量有關[6-7]。因此中藥治療發(fā)熱癥狀具有廣闊前景。

柴胡注射液誕生于20世紀40年代，其主要有效成分為柴胡揮發(fā)油，臨床解熱效果顯著，受輔料、工藝等條件限制，其不良事件頻發(fā)[8]，2018年國家藥品監(jiān)督管理局發(fā)布《關于修訂柴胡注射液說明書的公告》禁止其在兒童中使用。為滿足臨床需求，課題組前期采用水蒸氣蒸餾法精餾得柴胡揮發(fā)油，通過包合揮發(fā)油后熔融法制備小兒柴胡退熱栓，并自擬小兒柴胡退熱栓的質量標準和質量控制方法，目前正在申請《一種柴胡栓劑的制備方法》專利（專利號：201510375864.6）。為進一步明確小兒柴胡退熱栓的有效性，本實驗通過家兔耳緣靜脈注射內毒素建立發(fā)熱模型，觀測家兔行為學及肛溫變化，測定各組家兔血漿中炎癥因子和下丘腦中樞介質的水平變化，評價小兒柴胡退熱栓的解熱作用并初步探討其解熱機制，為小兒柴胡退熱栓的后期研究及應用奠定基礎。

1 材料

1.1 實驗動物

新西蘭家兔40只，體質量1.5～2.0 kg，2月齡，雌雄各半，雌兔無孕（湖北醫(yī)藥學院動物實驗中心，動物合格證號：No.4200090 0000938，No.42000900000946）。

1.2 試藥

小兒柴胡退熱栓（自制，生藥含量：1.20 g/粒，批號：20200805）；空白栓（自制，批號：20200805）；柴胡注射液（信合制藥有限公司，生藥含量：2 mL/支，1 mL相當于原生藥材1 g，批號：1708101）；小兒布洛芬栓（西南藥業(yè)有限股份公司，主藥含量：50 mg/粒，批號：20200604）；內毒素（湛江安度斯有限公司，批號：20070903）；兔TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA試劑盒（武漢華美生物工程有限公司）；兔cAMP、AVP、PGE2ELISA試劑盒（上海將來實業(yè)股份有限公司）；PBS緩沖液（美國Gibco公司，批號：8120329）。

1.3 儀器

全波長多功能酶標儀（美國Thermo公司，SB-079）；超速控溫離心機（德國Eppendorf公司，H1750R）；-80℃低溫冰箱（青島海爾有限股份公司，DE-251262）；-20℃低溫冰箱（青島海爾有限股份公司，DW-861626）；電熱恒溫箱（上海嘉鵬科技有限公司，DPH350）；純水儀（英國ELGA公司，PURELAB）；電子天平（美國Bio-Radg公司，MS205DU）；獸用電子體溫計（領航畜牧工廠）。

2 方法

2.1 小兒柴胡退熱栓的制備[9]

取柴胡飲片至10倍量的10%氯化鈉溶液中室溫浸泡8 h，采用水蒸氣蒸餾法提取柴胡揮發(fā)油2 h，收集初餾液，重蒸餾得柴胡揮發(fā)油精餾液。柴胡揮發(fā)油精餾液中加入β-環(huán)糊精，于50℃恒溫水浴磁力攪拌包合2 h，室溫冷卻后，2～8℃下靜置12 h，抽濾干燥得柴胡揮發(fā)油包合物。取半飽和脂肪酸甘油酯至燒杯中，于50℃水浴中攪拌至熔融，加入制得的柴胡揮發(fā)油包合物，攪拌均勻，保持流體狀，注入栓模中，室溫放置30 min，取栓，即得小兒柴胡退熱栓。

2.2 動物適應性操作

家兔適應飼養(yǎng)3 d，選擇體溫38.5～ 39.5℃，且體溫波動（△T）＜0.2℃的家兔入組，連續(xù)測量3次，取其平均值作為基礎肛溫。實驗環(huán)境：室溫（25±2）℃，相對濕度55%～ 70%，食用標準的家兔顆粒飼料，自由飲水。

2.3 動物造模、分組及給藥

入組的家兔25只，隨機分為5組，除空白組外，其余各組家兔分別于耳緣靜脈注射內毒素，1.5 h內誘導肛溫△T＞0.7℃為造模成功。造模成功后，各組家兔分別給予不同藥物進行干預。家兔分組及給藥劑量見表1。

表1 家兔分組及給藥劑量 Tab 1 Grouping of rabbits and dosing

2.4 觀測家兔行為學及肛溫變化

觀察各組家兔造模前后及給藥前后精神活動狀態(tài)、呼吸頻率等變化，記錄各組家兔行為學表征變化；并采用電子肛溫計分別于造模前、造模后1.5 h及給藥后0.5、1、1.5、2.5、3.5、4.5 h測量各組家兔肛溫變化。

2.5 標本采集

除空白組外，各組家兔分別在造模前、造模后1.5 h、給藥后1.5 h各采血2 mL，置于含EDTA的EP管中，放置室溫，以5000 r·min-1離心10 min，取上清液，置-20℃保存，備用。

各組家兔（末次）測量肛溫后，處死，取下丘腦于凍存管中，并迅速凍存于液氮罐中，于-80℃條件下保存，備用。

2.6 檢測血漿中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α含量

按試劑盒方法操作，于酶標儀450 nm波長處測定OD值，以對照品濃度為橫坐標，OD值為縱坐標繪制標準曲線，計算血漿中IL-1β、IL-6、TNF-α含量。

2.7 檢測下丘腦中發(fā)熱介質cAMP、AVP、PGE2含量

按試劑盒方法操作，于酶標儀450 nm波長處測定OD值，以對照品濃度為橫坐標，OD值為縱坐標繪制標準曲線，計算下丘腦中cAMP、AVP、PGE2含量。

2.8 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 小兒柴胡退熱栓對家兔行為學表征和肛溫變化影響

觀察各組家兔行為學表征發(fā)現(xiàn)，與空白組相比，其余各組注入內毒素1 h后家兔出現(xiàn)聳毛、兔體觸之發(fā)燙、畏冷縮團、呼吸加快等變化，且個別家兔出現(xiàn)喘促、鼻煽、躁動、納差等行為表現(xiàn)；小兒柴胡退熱栓組及陽性對照組（柴胡注射液組和小兒布洛芬栓組）給予藥物干預1 h后家兔逐漸恢復正?；顒?。

與空白組相比，各給藥組家兔給予內毒素1.5 h后肛溫顯著升高，說明造模成功；與模型組相比，各給藥組在給藥后1～2.5 h家兔肛溫顯著降低并至正常水平（見圖1）。

圖1 小兒柴胡退熱栓對發(fā)熱家兔肛溫變化影響（n＝5）Fig 1 Effect of Xiaoer Chaihu Tuire suppository on anal temperature in febrile rabbits（n＝5）

3.2 小兒柴胡退熱栓對發(fā)熱家兔血漿中IL-1β、IL-6、TNF-α含量變化的影響

與造模前相比，各組家兔造模后1.5 h IL-1β、IL-6、TNF-α含量顯著升高；與造模后1.5 h相比，各給藥組給予藥物干預1.5 h后IL-1β、IL-6、TNF-α含量顯著降低（見圖2）。

圖2 小兒柴胡退熱栓對發(fā)熱家兔血漿中IL-1β、IL-6、TNF-α含量變化影響（n＝5）Fig 2 Effect of Xiaoer Chaihu Tuire suppository on the serum levels of IL-1β，IL-6，and TNF-α in fever rabbits（n＝5）

3.3 小兒柴胡退熱栓對發(fā)熱家兔下丘腦中cAMP、AVP、PGE2含量變化的影響

與空白組相比，模型組家兔造模后1.5 h后cAMP、PGE2含量顯著升高，AVP含量顯著降低；與模型組相比，各給藥組給予藥物干預1.5 h后cAMP、PGE2含量顯著降低，AVP含量顯著升高，見圖3。

圖3 小兒柴胡退熱栓對發(fā)熱家兔下丘腦中cAMP、AVP、PGE2含量變化影響（n＝5）Fig 3 Effect of Xiaoer Chaihu Tuire suppository on the hypothalamus levels of cAMP，AVP，and PGE2 in fever rabbits（n＝5）

4 討論

本課題組前期以柴胡注射液的制備工藝為基礎，對揮發(fā)油進行包合后制備小兒柴胡退熱栓，為進一步明確小兒柴胡退熱栓解熱效果，實驗設計中以小兒布洛芬栓和柴胡注射液兩種藥物作為陽性對照。實驗選擇在造模后給予藥物，目的是評價小兒柴胡退熱栓對發(fā)熱家兔體溫變化的影響。因動物個體差異性，本實驗準備40只新西蘭家兔，篩選出基礎體溫合格及造模成功的25只家兔用于實驗。依據(jù)2020年版《中國藥典》一部規(guī)定[10]，柴胡用量為3～10 g，根據(jù)質量與體表面積轉換因子折算[11]，家兔的用藥劑量最大應為0.54 g·kg-1。

通過預實驗發(fā)現(xiàn)小兒柴胡退熱栓劑量為0.54 g·kg-1時解熱效果并不顯著，分析可能有以下原因[12]：

① 同一種中藥，不同劑量發(fā)揮不同作用，小劑量的柴胡（1～2 g）適于升陽舉氣；中劑量的柴胡（6～12 g）主要用于疏肝解郁；大劑量的柴胡（15～30 g）主要用于和解少陽，適合于往來寒熱者。② 藥典規(guī)定的劑量只能作為臨床參考標準，中藥劑型也對劑量有影響。因此擬訂小兒柴胡退熱栓的劑量為0.80 g·kg-1，結果表明小兒柴胡退熱栓可顯著降低發(fā)熱家兔體溫。后續(xù)實驗將會對小兒柴胡退熱栓的家兔體內代謝學和毒性實驗進一步研究。

內毒素為外源性致熱源，屬于中醫(yī)溫病“外感發(fā)熱”范疇，其大量進入血液后會促進巨噬細胞等分泌TNF-α、IL-1β、IL-6等致熱因子，可直接或間接刺激環(huán)氧合酶（COX2）的合成，使下丘腦釋放的發(fā)熱介質cAMP、PGE2增加，AVP釋放減少，從而產生熱源反應[13-14]。有研究通過家兔耳緣靜脈注射內毒素建立發(fā)熱模型，明確穿心蓮軟膠囊解熱作用，結果顯示穿心蓮軟膠囊對發(fā)熱家兔有明顯的解熱作用，其機制可能是穿心蓮軟膠囊可顯著降低發(fā)熱家兔腦脊液及下丘腦組織中cAMP含量[15]；亦有研究發(fā)現(xiàn)赤雹果總有機酸對內毒素致熱大鼠降溫作用的機制可能與下調發(fā)熱大鼠血清中TNF-α、PGE2、IL-1β及腦脊液中PGE2的水平有關[16]。本研究結果顯示，與模型組相比，小兒柴胡退熱栓組血漿中TNF-α、IL-1β、IL-6和下丘腦中cAMP、PGE2等含量均降低，AVP含量升高，說明小兒柴胡退熱栓的解熱作用機制可能與下調TNF-α、IL-1β、IL-6、cAMP、PGE2，上調AVP含量水平有關。但目前有關柴胡揮發(fā)油解熱作用與何種通路相關，尚未見文獻報道，本實驗可為后續(xù)柴胡揮發(fā)油分子水平機制研究及小兒柴胡退熱栓的臨床應用提供理論依據(jù)。