梁雨璐，李憶紅，雷艷，劉傳鑫，黃建梅*（1.北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京 102488；2.河南科技大學臨床醫(yī)學院，河南科技大學第一附屬醫(yī)院內分泌代謝中心，河南省遺傳罕見病醫(yī)學重點實驗室，國家代謝性疾病臨床醫(yī)學研究中心洛陽分中心，河南 洛陽 471003；3.北京中醫(yī)藥大學中藥學院 中藥品質評價北京市重點實驗室，北京 102488）

酸棗仁（Ziziphi Spinosae Semen）為鼠李科植物酸棗[Ziziphus jujubaMill.var.spinosa（Bunge）Hu ex H.F.Chou]的干燥成熟種子，主產于河北、陜西、山西、遼寧、河南等省，具有養(yǎng)心補肝，寧心安神，斂汗，生津的功效，主要用于虛煩不眠，驚悸多夢，體虛多汗，津傷口渴等證[1]。酸棗仁的主要成分為萜類、黃酮類、脂肪酸、揮發(fā)油、生物堿、多糖以及一系列吲哚衍生物等[2]，其中皂苷類、黃酮類成分具有鎮(zhèn)靜安眠的作用。另外酸棗仁還具有抗驚厥、抗抑郁、抗焦慮、改善心血管系統(tǒng)疾病、抗氧化、抗炎、增強記憶等藥理作用[3]。

酸棗仁的藥理作用與其成分息息相關，近年來利用LC-MS技術對酸棗仁的成分分析研究較多，而酸棗除藥用部位果仁以外，其他部位成分的研究鮮有報道。酸棗的其他部位同樣具有藥用價值，酸棗葉能改善睡眠[4]，具有保肝[5]、抗氧化、抑菌[6]等作用；酸棗果肉也被證明具有鎮(zhèn)靜催眠[7]、抗氧化[8]等作用。因此，充分了解酸棗葉及果肉的化學成分可以促進其有效利用。

為了更加簡便、快速地分析鑒定中藥復雜體系中的化學成分，本研究采用了UPLC-Q-TOF/MSE和UHPLC-Q-Exactive/MS技術，對寧夏回族自治區(qū)石嘴山市北武當賀蘭山腳下野生酸棗的不同部位中化學成分進行定性分析，從而了解酸棗不同部位的成分差異，為酸棗葉、果肉功效的深入研究以及野生酸棗的開發(fā)利用奠定了理論基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器

ACQUITY超高效液相色譜系統(tǒng)串聯(lián)SYNAPT G2-Si質譜儀（美國Waters公司，離子源為電噴霧離子源ESI，配有MassLynx V4.1工作站），超高效液相色譜與質譜聯(lián)用儀（Thermo Scientific Q Exactive LC-MS）[美國Thermo Fisher公司，離子源為電噴霧離子源（ESI），配有Xcalibur 3.0工作站]，電子天平ME104E/02（瑞士Mettler Toledo公司），KQ-100DB型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），UNIFI 1.8（美國Waters公司），高速臺式冷凍離心機（上海安亭科學儀器廠），MILLI-Q Advantage A10超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）。

1.2 材料

乙腈、甲酸[質譜級，賽默飛世爾科技（美國）有限公司]。水為質譜級超純水。甲醇（分析純，天津市致遠化學試劑有限公司）。酸棗藥材采于寧夏回族自治區(qū)石嘴山市北武當賀蘭山腳下，經北京中醫(yī)藥大學楊瑤珺教授鑒定為鼠李科植物酸棗[Ziziphus jujubaMill.var.spinosa（Bunge）Hu ex H.F.Chou]的干燥成熟果實及枝葉。

2 方法與結果

2.1 供試品溶液的制備

洗凈的酸棗果實、葉片于105℃烘干24 h，取葉片、果肉及果仁粉碎后過4號篩得到粉末，稱取酸棗葉、果仁、果肉粉末各0.2 g放入50 mL具塞錐形瓶中，加入20 mL50%甲醇，30℃超聲1.5 h，濾過，收集濾液，12 000 r·min-1高速離心10 min，取上清液即得。

2.2 色譜條件

采用UPLC-Q-TOF/MSE和UHPLC-Q-Exactive/MS技術對酸棗各部位中的化合物進行分析。

色譜柱為Waters ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；柱溫為35℃，體積流量為0.3 mL·min-1；進樣量為5 μL；流動相為0.1%甲酸水溶液（A）和0.1%甲酸乙腈（B），梯度洗脫（0～8 min，2%～9%B；8～18 min，9%～32%B；18～20 min，32%～89%B；20～35 min，89%～98%B；35～37 min，98%～2%B，37～40 min；2%B）。

2.3 質譜條件

① 采用SYNAPT G2-Si質譜儀，離子源為ESI，在正離子模式下進行質譜檢測分析。輔助噴霧電離與脫溶劑氣體使用的是高純N2，N2溫度為120℃；干燥氣流速為10 mL·min-1；霧化氣氣壓為310 kPa；脫溶劑N2流速為900 L·h-1；錐孔反吹氮氣為50 L·h-1；毛細管電離電壓和錐孔電壓分別為500 V、40 V；高能通道碰撞能量為40～65 eV；四極桿質量掃描范圍：m/z50～1500 Da，掃描時間0.2 s，進行質譜檢測分析[9]。

② 采用Q Exactive質譜儀，ESI在負離子模式下進行分析，掃描范圍設定為m/z100～1500 Da。具體的質譜條件參數：毛細管電壓3200 V；毛細管溫度為350℃，離子源溫度為350℃；采用高純N2作為鞘氣和輔助氣，鞘氣流速為35 L·h-1，輔助氣流速為15 L·h-1；采用Thermo Xcalibur 3.0工作站處理數據[10]。

2.4 數據分析

利用中國知網（CNKI），SciFinder，PubMed上已有文獻與中藥系統(tǒng)藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）檢索酸棗的化學成分，將檢索得到的化學成分進行整合、去除重復項后通過PubChem，ChemSpider等平臺或數據庫下載各化合物的mol格式的文件，建立酸棗各部分的化學成分信息數據庫。

基于MassLynx V4.1工作站和以中藥數據庫為基礎的UNIFI 1.8軟件對正離子模式數據進行采集與分析，將酸棗化合物信息條目導入庫中，設定高能通道閾值為25.0，低能通道閾值為200.0，選擇運行碎片分析功能，選取的相關加和離子為H＋，Na＋，K＋，NH4＋，輸入lockmass值（556.2766）校正質量數，設定誤差Error的絕對值不超過1.5×10-5。同時也基于文獻和人類代謝組數據庫（Human Metabolome Database，HMDB，www.hmdb.ca），收集相關化合物的二級碎片和保留時間進行比對，保留時間接近并且誤差Error的絕對值不超過1×10-5鑒定為同一化合物。

采用Xcalibur 3.0工作站將Thermo儀器產生的“.raw”格式的負離子模式數據打開，查詢相關文獻收集化合物的二級碎片和保留時間，保留時間接近并且誤差Error的絕對值不超過5×10-6鑒定為同一化合物。

2.5 化學成分的鑒定

野生酸棗仁、葉、果肉樣品溶液按 “2.2”和“2.3”項下的色譜及質譜條件進行分析，得到其在正、負離子模式下的BPI圖（見圖1）。結合UNIFI數據庫匹配和已有文獻報道以及HMDB數據庫比對，確定化合物的分子式及裂解規(guī)律，鑒定出黃酮類化合物20種，生物堿類化合物8種，萜類化合物12種，脂肪酸類化合物8種，核苷類化合物5種，氨基酸類化合物5種，有機酸類化合物3種，甾體類化合物1種，總計62種化合物，鑒定結果見表1[11-27]。其中，酸棗仁鑒定出42種化合物，酸棗葉鑒定出41種化合物，酸棗果肉鑒定出28種化合物。

圖1 野生酸棗仁（a）、葉（b）、果肉（c）在正離子模式（A）和負離子模式（B）下的基峰離子流圖Fig 1 Base peak ion in the positive ion mode（A）and the negative mode（B）in the kernel（a），leaf（b）and sarcocarp（c）of wild sour jujube

表1 UPLC-Q-TOF/MSE和UHPLC-Q-Exactive/MS法鑒定野生酸棗不同部位的化學成分 Tab 1 Compounds from different parts of wild sour jujube by UPLC-Q-TOF/MSE and UHPLC-Q-Exactive/MS

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

2.6 化學成分質譜裂解途徑分析

從黃酮類、生物堿類、萜類化合物中各選取了一種代表性化合物，對其進行了裂解規(guī)律分析。

化合物12：正離子檢測模式下，tR為9.86 min，準分子離子峰[M＋H]＋的m/z為286.1471，推測其分子式為C17H19NO3。在二級質譜圖中，果仁獲得MS/MS碎片的m/z分別為237.1644，209.1044，175.0847，107.0457；葉片獲得MS/MS碎片的m/z分別為269.0630，237.1240，209.0350，175.1078；果肉獲得MS/MS碎片的m/z分別為237.0501，175.1078，143.0529，107.0547。推測化合物12的二級質譜圖中[M＋H]＋失去1分子NH3形成m/z269的[M＋H-NH3]＋碎片離子，[M＋H-NH3]＋失去1分子CH3OH形成m/z237的[M＋H-NH3-CH3OH]＋碎片離子，[M＋H-NH3-CH3OH]＋失去1分子CO形成m/z209的[M＋H-NH3-CH3OH-CO]＋碎片離子；[M＋H]＋失去1分子C6H9NO形成m/z175的[M＋H-C6H9NO]＋碎片離子，[M＋H-C6H9NO]＋失去1分子CH3OH形成m/z143的[M＋H-C6H9NO-CH3OH]＋碎片離子；[M＋H]＋失去1分子C10H13NO2形成m/z107的[M＋H-C10H13NO2]＋碎片離子[14-15]。通過對其裂解過程的分析，初步鑒定化合物為生物堿類成分烏藥堿，廣泛分布于酸棗的仁、葉、果肉中，具體裂解規(guī)律見圖2A。

化合物20：正離子檢測模式下，tR為12.54 min，準分子離子峰[M＋H]＋的m/z為609.1841，負離子檢測模式下，準分子離子峰[M＋H]-的m/z為607.16650，推測其分子式為C28H32O15。在二級質譜圖中，獲得MS/MS碎片，其m/z分別為447.0494，429.3217，411.0050，381.0122，351.0997，327.0907，323.0921，308.0710，297.0756，267.0688。推測化合物20的二級質譜圖中[M＋H]＋失去1分子葡萄糖（162 Da）形成m/z447的[M＋H-Glc]＋碎片離子，[M＋H-Glc]＋失去1分子C4H8O4形成m/z327的[M＋H-Glc-C4H8O4]＋碎片離子，并在此處產生基峰[16]；[M＋H-Glc]＋失去1分子H2O形成m/z429的[M＋H-Glc-H2O]＋碎片離子，[M＋H-Glc-H2O]＋再失去1分子H2O形成m/z411的[M＋H-Glc-2H2O]＋碎片離子，[M＋H-Glc-H2O]＋失去1分子CH4O2形成m/z381的[M＋H-Glc-H2O-CH4O2]＋碎片離子，[M＋H-Glc-H2O]＋失去1分子C2H6O3形成m/z351的[M＋H-Glc-H2O-C2H6O3]＋碎片離子，[M＋H-Glc-H2O]＋失去1分子C5H8O4形成m/z297的碎片離子[17]，通過對其裂解過程的分析，初步鑒定化合物為黃酮類成分斯皮諾素，主要分布在酸棗的果仁和葉片中，具體裂解規(guī)律見圖2B。

化合物40：正離子檢測模式下，tR為19.41 min，準分子離子峰[M＋H]＋的m/z為1207.6130，[M＋NH4]＋的m/z為1224.6335，負離子檢測模式下，準分子離子峰[M＋H]-的m/z為1205.5941，推測其分子式為C58H94O26。在二級質譜圖中，獲得MS/MS碎片，其m/z分別為1057.2031，749.9297，733.5105，455.3582，437.3096。推測化合物40的二級質譜圖中，離子斷裂途徑開始于1分子H2O（18 Da）的中性損失，產生一個不穩(wěn)定的中間體，其中C20和C22之間產生雙鍵，C16-C17單鍵和C23-O（C16）單鍵斷裂，不穩(wěn)定的中間體通過RDA裂解立即轉化為m/z1189的離子[M＋H-H2O]＋[18]，[M＋H-H2O]＋失去1分子Xyl形成m/z1057的 [M＋H-Xyl]＋碎片離子，[M＋H-Xyl]＋失去1分子Glc后再失去1分子Glc或Rha形成m/z733的[M＋H-Xyl-2Glc]＋和m/z749的 [M＋H-Xyl-Glc-Rha]＋碎片離子，之后失去所有的糖得到17-Ebelin lactone，形成m/z455的碎片離子峰 [M＋H-C28H47O23]＋，并在m/z437（C30H45O2）處產生一系列的優(yōu)勢產物離子[16]。通過對其裂解過程的分析，初步鑒定化合物為皂苷類成分酸棗仁皂苷A，主要分布在酸棗仁中，具體裂解規(guī)律見圖2C。

圖2 烏藥堿（A）、斯皮諾素（B）和酸棗仁皂苷A（C）的推測裂解途徑Fig 2 Possible fragmentation pathways for coclaurine（A），spinosin（B）and jujuboside A（C）

3 討論

3.1 不同部位化學成分差異

黃酮類化合物及萜類化合物主要分布在酸棗的果仁和葉片中，果仁中鑒定出15種黃酮類化合物，5種萜類化合物；葉片中鑒定出11種黃酮類化合物，11種萜類化合物。果肉中鑒定出3種黃酮類化合物，4種萜類化合物，這兩類成分在果肉中含量較少、離子強度較低。研究表明，酸棗抗氧化活性成分主要為黃酮類及萜類化合物，總還原能力酸棗葉＞酸棗仁＞酸棗果肉[19]，與本研究中這兩類成分種類分布的趨勢相符。

黃酮類及萜類化合物也是酸棗主要的鎮(zhèn)靜安眠成分[20]，果仁中黃酮類化合物種類豐富，萜類化合物的種類比葉片少，然而6'''-對香豆酰斯皮諾素[21]、6'''-阿魏酰斯皮諾素、酸棗仁皂苷A[22]等具有鎮(zhèn)靜安眠作用的藥效成分主要分布在果仁中，其他藥效成分斯皮諾素[22]、當藥黃素[23]、酸棗仁皂苷B、山茶苷 B和白樺脂酸[24]主要分布在果仁和葉片中，當藥黃素和白樺脂酸分布于三個部位中。酸棗葉片中的黃酮類及萜類成分種類多，這表明酸棗葉也具有很好的鎮(zhèn)靜安眠作用，與已有的報道相符[25]，具有很大的開發(fā)潛力。酸棗果肉中這兩類成分種類較少，鎮(zhèn)靜安眠作用可能比較弱，后續(xù)需進行相關藥理實驗研究證明酸棗不同部位鎮(zhèn)靜催眠作用的強弱。

生物堿類和脂肪酸類成分在酸棗三個部位分布較均勻，酸棗中的生物堿具有抗驚厥[26]、催眠[27]的作用；果仁中的亞油酸及果肉中的亞麻酸屬于不飽和脂肪酸，具有鎮(zhèn)靜催眠作用[28]。

3.2 野生酸棗資源綜合開發(fā)與利用

酸棗仁是治療失眠的各種中藥制劑中最常用的組分[29]，酸棗不僅應用于醫(yī)療，也應用于食品保健，人們對酸棗的需求量日益增大，近年來各地酸棗仁的價格持續(xù)高漲，出現(xiàn)了供不應求的現(xiàn)象。寧夏石嘴山市北武當賀蘭山腳下?lián)碛胸S富的酸棗資源，但綜合開發(fā)利用的深度不夠。本研究發(fā)現(xiàn)，酸棗除果仁部位以外，葉片及果肉也富含黃酮和萜類等活性成分。酸棗葉已被用于開發(fā)功能性飲料、食品添加劑、牲畜飼料等產品[30]，但其尚未得到廣泛而充分的利用。此外，酸棗葉還可用于提取黃酮和萜類成分，相比于果實的獲取受季節(jié)限制，葉片無論采摘、貯存和運輸都具有較大優(yōu)勢。果肉中活性成分較少，適合開發(fā)為果脯類零食，不僅口感更佳，而且具有一定安神的作用，適合常年失眠多夢的患者使用，具有較大的市場需求。

開發(fā)賀蘭山野生酸棗具有很高的商業(yè)價值，但是過度采摘容易造成資源匱乏，破壞野生酸棗種質資源。因此應該在保護野生種質資源的基礎上，合理地開發(fā)和利用賀蘭山野生酸棗資源，實現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展，這不僅可以滿足市場的需求，提高酸棗的遺傳多樣性，還可以為選育抗逆性優(yōu)良的酸棗新品種提供寶貴的基礎材料，也為當地實現(xiàn)產業(yè)升級、中草藥資源開發(fā)和經濟轉型提供新的思路。

3.3 不足和局限性

本研究也存在一定局限性，首先，由UPLCQ-TOF/MSE和UHPLC-Q-Exactive/MS鑒定到的化合物無對照品進行比對，可能存在一定的假陽性情況；其次，研究采用的酸棗數據庫都是已知成分，野生酸棗中存在的未知成分尚無法鑒定；再次，本研究僅使用50%甲醇部位進行成分提取研究，提取工藝有待優(yōu)化；最后，本研究每個部位僅有1個樣品，且質譜本身具有靈敏度的局限性，本方法鑒定得到的化合物并不代表酸棗中的全部成分，后續(xù)應增加樣品數量及實驗批次。由于色譜峰數量多而復雜，在離子流圖中有一些響應較好的峰尚未定性，因此溶劑、色譜、質譜條件還有待優(yōu)化，化學成分需要進一步研究。

4 結論

綜上分析，本研究采用了UPLC-Q-TOF/MSE和UHPLC-Q-Exactive/MS技術，對寧夏回族自治區(qū)石嘴山市北武當賀蘭山腳下野生酸棗的不同部位（果仁、葉片、果肉）中化學成分進行定性分析；同時初步探索了賀蘭山野生酸棗的種屬分布，表明其作為藥用酸棗的可行性，有利于在一定程度上緩解酸棗資源供不應求的現(xiàn)狀，也為賀蘭山野生酸棗資源的綜合開發(fā)和利用提供依據。