顏淵鴛，章波（.海南省第三人民醫(yī)院藥劑科，海南 三亞 57000；.桂林醫(yī)學院科學實驗中心，廣西 桂林 5499）

肺癌在中國的發(fā)病率和病死率均較高，且是世界上病死率最高的惡性腫瘤[1]。根據(jù)不同的組織學行為和病理表現(xiàn)，原發(fā)性肺癌主要分為小細胞肺癌（SCLC）和非小細胞肺癌（NSCLC）[2]。其中，NSCLC占肺癌病例的80%～85%，這是一種以基因突變的分子亞型為特征的疾病[3]。目前，含鉑類藥物為晚期NSCLC的一線藥物，其作用機制為通過與DNA結(jié)合產(chǎn)生復合物，導致DNA斷裂并出現(xiàn)錯誤編碼，進而干擾DNA正常生理功能，發(fā)揮抗腫瘤作用[4]。然而，研究表明，多數(shù)晚期NSCLC患者經(jīng)鉑類一線化療后效果欠佳。雖然增加劑量強度可提高療效，但不良反應亦隨之加強，不利于患者耐受[5]。除增加劑量強度外，聯(lián)合用藥亦可提高藥物療效。隨著中醫(yī)藥受重視程度日益增高，越來越多的中藥在癌癥的治療過程中展現(xiàn)出獨特的療效[6]。復方苦參注射液（CKI）具有散結(jié)止痛、涼血解毒等功效，在臨床中可用于NSCLC的輔助治療[7-8]。然而，其抗NSCLC的作用機制尚不明確。網(wǎng)絡藥理學在探索中藥藥理機制方面擁有巨大優(yōu)勢，其可借助公共數(shù)據(jù)庫[9]和文獻，獲得藥物成分和特定疾病的靶點信息，進而預測藥物防治疾病的有效成分、藥效靶點。此外，借助生物信息學分析可進一步挖掘其及可能參與調(diào)控的細胞信號轉(zhuǎn)導通路等[10]。

本文擬通過網(wǎng)絡藥理學的方法探索CKI抗NSCLC的分子機制，并通過實時熒光定量PCR（qPCR）實驗對關鍵基因進行驗證，以期為CKI在臨床合理應用提供科學有效的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 CKI有效成分收集

查閱文獻發(fā)現(xiàn)，Ma等[11]使用LC-MS/MS對CKI進行分析，共鑒定出21個有效成分。經(jīng)Pubchem數(shù)據(jù)庫中搜索后，共導出16個有效成分（見表1）可用于后續(xù)網(wǎng)絡藥理學分析的有效成分三維結(jié)構數(shù)據(jù)。

表1 CKI有效成分信息 Tab 1 Information of active ingredients in CKI

1.2 CKI有效成分靶點預測

將上述16個有效成分的三維結(jié)構均保存為mol2格式，并上傳至Pharm Mapper 數(shù)據(jù)庫[12-14]（http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）?；诜聪蛩幮F匹配法，選擇藥物的藥效團模型，設置最終產(chǎn)生300個蛋白構象，得到與CKI中16個有效成分相關的靶點名稱、基因名稱、Uniprot ID等結(jié)果。合并16個有效成分相關的靶點，導入 UniProt數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/），選擇物種為“Homo sapiens”，剔除重復、非人源與不規(guī)范的靶點，最終得到與CKI有效成分相關的蛋白靶點。

1.3 收集NSCLC相關靶點

分別在Drug Bank（https：//www.drugbank.ca/）、CTD（http：//ctd.mdibl.org/）、Gene Cards（https：//www.genecards.org/）、OMIM（https：//omim.org/）數(shù)據(jù)庫檢索NSCLC相關靶點。為了減少假陽性結(jié)果，CTD數(shù)據(jù)庫中NSCLC相關靶點選取基因總數(shù)的1%作為后續(xù)研究靶點，Gene Cards數(shù)據(jù)庫中NSCLC相關靶點僅選取評分大于20的基因作為后續(xù)研究靶點，Drug Bank數(shù)據(jù)庫和OMIM數(shù)據(jù)庫收集全部靶點。合并4個數(shù)據(jù)庫的靶點即為NSCLC相關靶點。

1.4 蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡（PPI）構建

將CKI有效成分相關靶點與NSCLC相關靶點取交集，得到CKI抗NSCLC潛在作用靶點。再將潛在作用靶點導入STRING（http：//string-db.org/）數(shù)據(jù)庫，物種限定為人類，獲得潛在作用靶點蛋白互作關系文件。提取上述文件中 node1、node2 和 Combined score 信息導入 Cytoscape 3.8.2 軟件進行可視化分析，運用軟件中Network Analyzer功能計算蛋白互作網(wǎng)絡的拓撲參數(shù)。根據(jù)拓撲參數(shù)中的度值（degree）來篩選核心蛋白，即任意蛋白度值大于所有蛋白度值中位數(shù)，則認為該蛋白為CKI抗NSCLC潛在作用靶點中的關鍵靶點。

1.5 關鍵靶點生物信息學分析

將篩選出的關鍵靶點的蛋白名均轉(zhuǎn)換為Gene Symbol，并以該格式導入 David 6.8 數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/），進行GO分析及KEGG通路分析。下載David數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果，數(shù)據(jù)經(jīng)整理后使用R語言中ggplot2包進行可視化。

1.6 A549細胞體外實驗驗證

1.6.1 材料 A549細胞株（中國科學院上海細胞庫）。CKI（山西振動制藥股份有限公司，批號：20210106）；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Gibco公司）；CCK-8試劑盒（美國MedChemExpress公司）；TRIzol試劑（美國Ambion公司）；qPCR試劑盒（日本TaKaRa公司）；PCR引物[生工生物工程（上海）股份有限公司]。TECAN SPARK酶標儀、QuantStudio 5實時熒光定量PCR儀（美國Thermo公司）；Galaxy 170 S培養(yǎng)箱（英國New Brunswick公司）。

1.6.2 細胞分組及給藥 A549細胞在37℃、5% CO2飽和濕度下，培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)液中（含 10% 胎牛血清、100 U·mL-1青霉素及 0.1 mg·mL-1鏈霉素）。實驗共分為3組，正常對照組（A549細胞，不加藥物干預），CKI低劑量組（培養(yǎng)基中CKI含量為40 μL·mL-1），CKI高劑量組（培養(yǎng)基中CKI含量為80 μL·mL-1）。

1.6.3 細胞活性實驗 采用CCK-8試劑盒檢測細胞活性。取1×104個·mL-1的細胞懸液100 μL接種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁后，按照“1.6.2”項下分組對細胞進行藥物處理，每組6個復孔。藥物處理24 h，每孔加入10 μL CCK-8試劑，于37℃、5%CO2飽和濕度下孵育1 h，用酶標儀在450 nm處測定吸光度值，并計算細胞存活率（%）。

1.6.4 qPCR檢測參與調(diào)控相關信號通路基因的mRNA相對表達 A549細胞經(jīng)CKI干預24 h后，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗細胞5次，TRIzol試劑提取各組細胞總RNA，于260 nm處測量其吸光度值，測定總RNA濃度。利用隨機六聚體引物和SuperScript Ⅲ逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒獲得互補DNA（cDNA）。逆轉(zhuǎn)錄后采用20 μL體系進行qPCR檢測mRNA相對表達量，結(jié)果采用 2-ΔΔCt法進行相對定量分析。引物序列見表2。

表2 引物序列 Tab 2 Primer sequences

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 CKI和NSCLC靶點分析

將CKI的16個有效成分上傳至Pharm Mapper 數(shù)據(jù)庫后，剔除非人源靶點后，共收集到372個CKI靶點，NSCLC靶點426個。將CKI和NSCLC靶點進行對比分析，得到40個CKI抗NSCLC潛在作用靶點（見圖1）。通過STRING數(shù)據(jù)庫及Cytoscape軟件，繪制了40個CKI抗NSCLC潛在作用靶點的PPI網(wǎng)絡（見圖2）（其中紅色代表基因在該網(wǎng)絡度值大于各靶點度值中位數(shù)，藍色代表小于中位數(shù)。紅色靶點視為CKI抗NSCLC關鍵靶點）。對PPI網(wǎng)絡進行拓撲分析后發(fā)現(xiàn)，該網(wǎng)絡中平均聚類系數(shù)為0.63，平均節(jié)點度為11.48，平均最短路徑為1.37～3.42，介數(shù)中心0.29～0.73，在關系網(wǎng)絡中體現(xiàn)了較好的連通特性（見表3）。同時，根據(jù)拓撲參數(shù)中的度值，選取大于度值中位數(shù)的靶點作為CKI抗NSCLC潛在作用的關鍵靶點，共19個（見圖2）。

表3 CKI抗非小細胞肺癌作用靶點互作關系的拓撲學分析 Tab 3 Topological analysis of the interaction between CKI targets against NSCLC

圖1 CKI和NSCLC靶點韋恩圖Fig 1 Venn diagram of CKI and NSCLC targets

圖2 CKI抗NSCLC潛在作用靶點PPI網(wǎng)絡Fig 2 PPI network of potential CKI targets against NSCLC

2.2 CKI抗NSCLC關鍵靶點GO分析

將19個關鍵靶點導入David數(shù)據(jù)庫，進行GO分析。結(jié)果顯示，GO分析中，19個關鍵靶點參與了93個生物過程（BP），包括轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、基因表達的正調(diào)控、RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉(zhuǎn)錄正調(diào)控等；13個細胞組分（CC），包括細胞核、細胞膜、核染色質(zhì)等；27個分子功能（MF），包括酶結(jié)合、蛋白激酶綁定、ATP結(jié)合等。按照參與基因功能的基因個數(shù)，選取各基因功能前十個條目，應用R 4.10軟件將其繪制成條圖進行可視化（見圖3）。

圖3 CKI抗NSCLC關鍵靶點GO分析條圖Fig 3 GO analysis of key CKI targets against NSCLC

2.3 CKI抗NSCLC關鍵靶點

將19個關鍵靶點導入David數(shù)據(jù)庫，進行KEGG信號通路富集分析。結(jié)果顯示，19個關鍵靶點參與調(diào)控了30條信號通路，選取P值最小的20條信號通路繪制氣泡圖進行可視化（見圖4）?？梢园l(fā)現(xiàn)，與NSCLC相關的信號通路主要有缺氧誘導因子1（HIF-1）信號通路、絲裂原活化蛋白激酶（AMPK）信號通路、磷脂酰肌醇3'-激酶（PI3K-Akt）信號通路。此外，KEGG信號通路富集分析的數(shù)據(jù)顯示，共6個基因參與調(diào)控上述3條與NSCLC相關的信號通路，分別為ERBB2、MTOR、CCND1、IGF1R、VEGFA、FN1（見表4）。

圖4 CKI抗NSCLC關鍵靶點KEGG信號通路富集分析氣泡圖Fig 4 Enrichment analysis of KEGG signaling pathway，a key CKI target against NSCLC

2.4 CKI對A549細胞活性的影響

CCK-8實驗結(jié)果顯示，相比于正常對照組，經(jīng)給藥培養(yǎng)24 h后，CKI低、高劑量組中A549細胞活性有顯著下降趨勢，且A549細胞活性下降趨勢呈劑量依賴性，表明CKI具有抑制A549細胞活性的作用（見圖5）。

圖5 CKI對A549細胞活性的影響CCK-8實驗結(jié)果Fig 5 Effect of CKI on A549 cell viability by CCK-8

2.5 qPCR檢測參與調(diào)控相關信號通路基因的mRNA相對表達

qPCR實驗結(jié)果顯示，相比于正常對照組，CKI低劑量組及高劑量組A549細胞中ERBB2、MTOR、IGF1R、VEGFAmRNA相對表達量顯著降低，CCND1、FN1 mRNA相對表達量差異無統(tǒng)計學意義（見圖6），表明CKI可能是通過抑制ERBB2、MTOR、IGF1R及VEGFA基因的表達調(diào)控HIF-1、AMPK及PI3K-Akt信號通路，進而發(fā)揮其抑制A549細胞活性的作用。

圖6 信號通路相關關鍵基因qPCR實驗結(jié)果Fig 6 qPCR of key genes related to signaling pathways

3 討論

本研究通過文獻及數(shù)據(jù)庫挖掘共找到19個CKI抗NSCLC的關鍵靶點，在對其進行GO分析后發(fā)現(xiàn)，靶點主要涉及到轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、基因表達的正調(diào)控、RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉(zhuǎn)錄正調(diào)控等生物學過程。同時，KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，CKI可能通過調(diào)控HIF-1信號通路、AMPK信號通路及PI3K-Akt信號通路等發(fā)揮抗NSCLC作用。此外，通過CCK-8細胞活性實驗證明CKI具有抑制NSCLC的作用。進一步的qPCR實驗驗證表明，CKI調(diào)控上述3條信號通路可能與抑制ERBB2、MTOR、IGF1R及VEGFA基因的表達有關。

缺氧是包括NSCLC在內(nèi)的實體腫瘤的一個特征，與腫瘤的惡性程度直接相關[15]。在缺氧腫瘤微環(huán)境中，缺氧誘導因子（HIF）被激活，激活的HIF誘導與血管生成、代謝調(diào)節(jié)、細胞凋亡和腫瘤生存相關的多個基因的表達[16]。HIF在血管形成和腫瘤血供恢復中的重要作用使腫瘤難以治療，導致對放療、化療和免疫治療產(chǎn)生抗藥性[17]。據(jù)報道，缺氧誘導因子-1α的上調(diào)與NSCLC的腫瘤壞死和患者總生存期相關[18]。因此，抑制HIF-1信號通路可能有助于NSCLC的治療。自噬是一種進化上保守的分解代謝機制，是真核細胞通過膜轉(zhuǎn)運途徑循環(huán)或降解內(nèi)部成分的一種機制，可以通過消除細胞異常增殖以維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)，有望成為治療癌癥的靶點[19]。研究表明，AMPK信號通路及PI3K-Akt信號通路均與細胞自噬的發(fā)生密切相關，抑制該通路的異常表達有助于癌癥的治療[20-21]。本研究中，通過網(wǎng)絡藥理學發(fā)現(xiàn)CKI抗NSCLC的作用機制可能與NSCLC細胞中HIF-1信號通路、AMPK信號通路及PI3K-Akt信號通路的異常表達有關。進一步通過qPCR實驗驗證發(fā)現(xiàn)，CKI可有效抑制與上述通路相關的CKI抗NSCLC靶點（ERBB2、MTOR、IGF1R、VEGFA）mRNA的表達。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡藥理學技術分析了CKI抗NSCLC的分子機制并對信號通路關鍵基因靶點進行qPCR實驗驗證，進一步為CKI的臨床應用提供了科學依據(jù)。然而，本研究并未對發(fā)現(xiàn)的HIF-1信號通路、AMPK信號通路及PI3K-Akt信號通路進行進一步的實驗驗證，使得本研究結(jié)論具有一定局限性。因此，CKI如何調(diào)控上述3條信號通路的實驗驗證或?qū)⒊蔀楹罄m(xù)研究重點。