許英，陳玲，張?zhí)m，朱斌，楊陽，王曉梅，洪倩*（1.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬淮海醫(yī)院，江蘇 徐州 221004；2.中國人民解放軍陸軍第七十一集團(tuán)軍醫(yī)院，江蘇 徐州 221004）

阿爾茨海默病（AD）是最常見的神經(jīng)退行性疾病，是老年人群中主要的癡呆癥。據(jù)估計，2018年全球有4400萬人患有AD。淀粉樣斑塊的積累和神經(jīng)原纖維纏結(jié)（NFT）的形成是AD的兩個典型病理特征。β-淀粉樣蛋白（Aβ）聚集在有害的寡聚體和原纖維中，包括神經(jīng)元細(xì)胞死亡。已知該寡聚體會誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，從而觸發(fā)神經(jīng)炎癥并加速疾病的發(fā)展。因此，抑制Aβ的產(chǎn)生，從治療和預(yù)防的角度來看可能是具有意義的。此外，tau過度磷酸化被認(rèn)為是tau蛋白病的主要誘因，大量證據(jù)表明，在體外和體內(nèi)多個AD相關(guān)位點都顯示強(qiáng)烈的tau磷酸化[1]。

阿魏酸（4-羥基-3-甲氧基肉桂酸，F(xiàn)A）是一種酚類化合物，天然存在于植物細(xì)胞的細(xì)胞壁中，已被證明具有廣泛的藥理作用，如抗炎、抗糖尿病、抗腫瘤、抗衰老和神經(jīng)保護(hù)。前期研究證實阿魏酸對脂多糖（LPS）刺激或Aβ25-35損傷的PC12細(xì)胞具有保護(hù)作用，表明阿魏酸具有潛在的神經(jīng)保護(hù)作用[2-4]。然而，關(guān)于阿魏酸降低Aβ水平作用的確切機(jī)制尚不清楚。在本研究中，課題組使用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了人類淀粉樣蛋白前體蛋白（APP）的人類神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞來評估阿魏酸對AD的影響及相關(guān)分子機(jī)制。

1 材料

1.1 試藥

阿魏酸（中國食品藥品檢定研究院，批號：110773-201614，通過歸一化HPLC-ELSD檢測確定純度超過98%）；MTS、caspase-Glo 3/7分析檢測試劑盒（Promega公司）；Tris緩沖液、甘氨酸、SDS和胎牛血清（BSA）（Amresco公司）；鹽酸嘌呤霉素、DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司）；Cleaved caspase-9、GAPDH兔單克隆抗體、山羊抗兔-HRP和山羊抗小 鼠-HRP（Cell Signaling Technology公司）；磷酸化GSK-3β（Y216）兔多克隆抗體（Abcam公司）；Aβ40和Aβ42 ELISA檢測試劑盒（Thermo Fisher Scientific）；Aβ42（Sigma-Aldrich）。其他化學(xué)藥品均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器

CO2培養(yǎng)箱（ThermoForma公司）；Quintix 224-1CN 型電子分析天平（最大載荷 220 g，分度值 0.1 mg，德國 Sartorius公司）；Western blot轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad公司）；電泳儀（Amersham公司）；TS-2型脫色搖床及 TS-8型轉(zhuǎn)移脫色搖床（江蘇海門市麒麟貝爾儀器制造有限公司）；Minispin5452 型高速離心機(jī)（德國 Eppendorf 公司）；Molecular Devices Flex Station 3微孔板讀數(shù)儀（美谷分子公司）；BC-5390CRP 型全自動細(xì)胞計數(shù)儀（邁瑞醫(yī)療國際公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及單克隆細(xì)胞系的建立

SH-SY5Y人類神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫（No.CRL-2266），進(jìn)口自ATCC。使用DMEM培養(yǎng)基[含10%胎牛血清，100 U·mL-1青霉素/鏈霉素，非必需氨基酸和丙酮酸鈉（1 mmol·L-1）]，于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。使用質(zhì)粒載體HBLV-H-APP-3XFLAGZNGREEN-PURO或HBLV-ZNGREEN-PURO（Hanbio）在SH-SY5Y細(xì)胞中構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)人APP的細(xì)胞系并命名為NC和SH-APP，通過在含嘌呤霉素（8 μg·mL-1）的選擇性培養(yǎng)基中維持培養(yǎng)。單克隆細(xì)胞系的構(gòu)建按照文獻(xiàn)所述的方法進(jìn)行[5-6]。

2.2 細(xì)胞活力測定

將細(xì)胞以每孔1×104個細(xì)胞的密度接種到96孔板中，并在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。將MTS（20 μL/孔）加入到每個孔中。溫育2 h后，使用微孔板讀數(shù)儀于450 nm處檢測吸光度。

2.3 Caspase-3/7活性測定

根據(jù)說明書的方法，使用caspase-Glo 3/7檢測試劑盒檢測caspase-3/7活性。具體方法為：將NC和SH-APP細(xì)胞以每孔1×104個細(xì)胞的密度接種到96孔板中，并用不同濃度的阿魏酸處理48 h。48 h后，每孔添加100 μL檢測試劑，并在黑暗中于室溫孵育1 h后，在微孔板上檢測發(fā)光，未處理細(xì)胞的caspase-3/7活性定義為相對100% caspase-3/7活性。

2.4 Aβ40和Aβ42分泌檢測

使用人Aβ40和Aβ42 ELISA試劑盒檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人APP細(xì)胞系中分泌的Aβ水平。將NC和SH-APP細(xì)胞在6孔板中培養(yǎng)過夜，并用不同濃度的阿魏酸處理細(xì)胞48 h。收集上清液，并向其中加入蛋白酶抑制劑。根據(jù)試劑盒說明操作，將上清液用作ELISA樣品，每個樣品一式兩份進(jìn)行分析。同時，保存細(xì)胞用于Western blot研究。

2.5 細(xì)胞凋亡檢測

采用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡，將NC和SH-APP細(xì)胞以每孔4×105個細(xì)胞的密度接種在6孔板中，并用不同濃度的阿魏酸處理細(xì)胞48 h。然后去除細(xì)胞培養(yǎng)基，并用PBS洗細(xì)胞兩次，收獲細(xì)胞并用含有Annexin 和PI試劑的結(jié)合緩沖液在黑暗中染色15 min，使用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞懸浮液進(jìn)行定量檢測，使用Flow Jo軟件對檢測結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2.6 蛋白質(zhì)印跡分析

將阿魏酸處理過的全細(xì)胞提取物在裂解緩沖液[20 mmol·L-1pH 7.4 Tris，250 mmol·L-1NaCl，2 mmol·L-1EDTA（pH 8.0），0.1% Triton X-100、0.01 mg·mL-1抑肽酶，0.005 mg·mL-1亮肽素，0.4 mmol·L-1PMSF和4 mmol·L-1NaVO4]中裂解。將裂解液在12 000×g下離心10 min以除去不溶物，并用10% SDS凝膠溶解。電泳后，將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂牛奶封閉，并加入一抗（1∶1000）4℃孵育過夜。洗滌印跡，將其暴露于含有辣根過氧化物酶（HRP）的二抗1 h，最后通過ECL化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行蛋白印跡檢測，蛋白質(zhì)的相對密度通過Image J軟件進(jìn)行分析。

2.7 Morris水迷宮實驗

2.7.1 動物分組 大鼠隨機(jī)分為7組，分別為正常組，假手術(shù)組，模型組，多奈哌齊陽性藥組，阿魏酸低、中、高劑量組（1.5、3、6 g·kg-1）。正常組和假手術(shù)組每組12只，雌雄各半，其余5組每組13只。

2.7.2 Aβ致AD癡呆模型的建立 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d后，采用立體定位技術(shù)雙側(cè)海馬注射Aβ42（2 μg·μL-1）5 μL建立大鼠AD模型。假手術(shù)組注射等體積的PBS，正常對照組不進(jìn)行注射。造模后一周開始灌胃給藥，剔除造模過程中死亡動物后，連續(xù)給藥5周。

2.7.3 水迷宮檢測 采用Morris水迷宮檢測大鼠空間學(xué)習(xí)記憶行為。第1、2日為可見平臺訓(xùn)練，第3、4、5日為隱藏平臺訓(xùn)練，第6日為空間探索實驗?？梢娖脚_訓(xùn)練：將插有旗子的水迷宮平臺（旗子高于平臺5 cm）置于水迷宮某一象限，放入25℃左右的水至沒過平臺1.5 cm。每日從四個象限（4個入水點）中將大鼠面向池壁放入水中，使其自由游泳90 s，90 s內(nèi)大鼠找到平臺并上臺停留15 s后將其從平臺上取下休息，并記錄大鼠從入水開始至爬上平臺所需的時間（潛伏期）。若90 s內(nèi)動物未找到平臺，則人為地將大鼠引導(dǎo)至平臺，并停留15 s，潛伏期記為90 s。隱藏平臺訓(xùn)練：將水迷宮平臺上插有的旗子撤去，但平臺所在的位置不變，放入25℃左右的水至沒過平臺1.5 cm。訓(xùn)練方法同可見平臺訓(xùn)練?？臻g探索實驗：撤除平臺，任選某一象限將各組大鼠依次從該象限面向池壁放入水中，使其自由游泳90 s，計算機(jī)監(jiān)測記錄大鼠在原平臺所在象限停留的時間及穿越原平臺所在區(qū)域的次數(shù)（行為學(xué)測試過程中應(yīng)保持光線柔和、室內(nèi)安靜、各參照物位置不變）。

2.8 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 16.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行獨立樣本t檢驗，計量結(jié)果均以±s表示，多組間比較，方差齊采用單因素方差分析，方差不齊則采用秩和檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，每個實驗重復(fù)3次或更多獨立實驗。

3 結(jié)果

3.1 SH-APP穩(wěn)定細(xì)胞株的構(gòu)建及驗證

本研究首先構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)人APP的細(xì)胞株，然后通過Western blot法和ELISA法分別檢測了穩(wěn)定細(xì)胞株中Aβ40和Aβ42的表達(dá)情況以驗證穩(wěn)定細(xì)胞株是否成功構(gòu)建。結(jié)果見圖1，Western blot檢測結(jié)果顯示，與NC細(xì)胞相比，SH-APP細(xì)胞中Aβ總蛋白的表達(dá)顯著升高。NC細(xì)胞和SH-APP細(xì)胞裂解物中Aβ40和Aβ42水平以及培養(yǎng)基中Aβ42水平均無顯著差異；SH-APP細(xì)胞培養(yǎng)基中的Aβ40水平顯著增加。上述結(jié)果提示SH-APP穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建成功，后續(xù)研究中選擇細(xì)胞培養(yǎng)基中Aβ40的分泌水平來進(jìn)行藥效的評估。

圖1 SH-APP細(xì)胞株的構(gòu)建及Aβ表達(dá)水平Fig 1 Construction of SH-APP cell line and expression level of Aβ

3.2 阿魏酸對SH-APP細(xì)胞活力及Aβ40水平的影響

與NC細(xì)胞相比，SH-APP的細(xì)胞活力顯著降低，表明SH-APP細(xì)胞具有潛在的神經(jīng)毒性，而不同濃度的阿魏酸（0.625～10 μmol·L-1）處理后可顯著提高細(xì)胞活力，提高細(xì)胞存活率（見圖2A）。同時，阿魏酸（0.625～10 μmol·L-1）處理SH-APP細(xì)胞48 h后能劑量依賴性地降低Aβ40分泌水平（見圖2B），結(jié)果表明阿魏酸在SH-APP細(xì)胞中具有潛在神經(jīng)保護(hù)作用。

圖2 阿魏酸對SH-APP細(xì)胞活力（A）和淀粉樣蛋白β（Aβ）分泌的影響（B）Fig 2 Effect of FA on SH-APP cells viability（A）and amyloid beta Aβ40 secretion（B）

3.3 阿魏酸對SH-APP細(xì)胞凋亡的影響

如圖3A所示，caspase-3/7活性檢測結(jié)果顯示，與SH-APP組相比，阿魏酸（1.25～10 μmol·L-1）處理的SH-APP細(xì)胞中caspase-3/7活性明顯降低。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，NC細(xì)胞中細(xì)胞凋亡率為3.3%，而SH-APP細(xì)胞中細(xì)胞凋亡率上升至10.49%，2.5、5、10 μmol·L-1阿魏酸處理后的SH-APP細(xì)胞中細(xì)胞凋亡率分別降低至4.0%、3.6%和3.3%，顯示阿魏酸具有顯著的抗凋亡作用（見圖3B），結(jié)果表明阿魏酸可能通過影響細(xì)胞凋亡發(fā)揮對SH-APP細(xì)胞的保護(hù)作用。

圖3 阿魏酸對SH-APP細(xì)胞凋亡的影響Fig 3 Effect of FA on the apoptosis of SH-APP cells

3.4 阿魏酸對SH-APP細(xì)胞tau蛋白磷酸化的影響

如圖4所示，與SH-APP組細(xì)胞相比，經(jīng)阿魏酸（6.25～25 μmol·L-1）處理的SH-APP細(xì)胞tau蛋白在絲氨酸199/202和396處的磷酸化水平顯著降低，表明阿魏酸抑制了 SH-APP細(xì)胞中的tau蛋白磷酸化。

圖4 阿魏酸對tau蛋白磷酸化的影響Fig 4 Effect of ferulic acid on tau hyperphosphorylation

3.5 阿魏酸對SH-APP細(xì)胞中GSK-3β及caspase-9蛋白的影響

與SH-APP組細(xì)胞相比，用 25 μmol·L-1阿魏酸處理的SH-APP細(xì)胞的p-GSK-3β（Y216）水平顯著降低（見圖5）。此外25 μmol·L-1阿魏酸能顯著抑制SH-APP細(xì)胞中裂解的caspase-9水平。上述結(jié)果提示阿魏酸可能通過調(diào)節(jié)GSK-3β相關(guān)的凋亡途徑發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

圖5 阿魏酸對GSK-3β和C-caspase-9的影響Fig 5 Effect of ferulic acid on GSK-3β and cleaved caspase-9

3.6 水迷宮實驗

采用Morris水迷宮檢測大鼠的空間學(xué)習(xí)、記憶能力，觀察阿魏酸對Aβ模型大鼠的改善作用。如表1所示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠表現(xiàn)出較長的潛伏期，表明其空間學(xué)習(xí)探索能力的損傷。與模型組大鼠相比，阿魏酸低、高劑量組大鼠潛伏期有所縮短，表明大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力得到一定改善。

撤出平臺后，水迷宮實驗中大鼠的行為由空間探索記憶能力決定。穿臺次數(shù)是評價空間探索記憶能力的一個指標(biāo)。如表1、圖6所示，經(jīng)5 d的訓(xùn)練后，模型組大鼠在90 s內(nèi)的穿臺次數(shù)比假手術(shù)組明顯減少。與模型組大鼠相比，阿魏酸各劑量組大鼠的穿臺次數(shù)明顯增加。此外，在空間探索階段，模型組大鼠在目標(biāo)象限停留的時間比假手術(shù)組有所縮短，阿魏酸各劑量組較模型組有較長的目標(biāo)象限停留時間，表明大鼠記憶能力有所改善。

圖6 大鼠在空間探索實驗中的軌跡圖Fig 6 Swimming track diagram of rats in space exploration test

表1 阿魏酸對大鼠Morris水迷宮實驗的影響 Tab 1 Effect of ferulic acid on model rat in Morris Water Maze Behavior test

4 討論

在本研究中，我們利用人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SHSY5Y細(xì)胞構(gòu)建了一種特征明確的穩(wěn)定表達(dá)人APP的SH-APP細(xì)胞AD模型，并初步考察了阿魏酸對SH-APP細(xì)胞的影響。結(jié)果顯示穩(wěn)定表達(dá)APP的SH-APP細(xì)胞中Aβ40的水平顯著升高，阿魏酸處理后減輕了SH-APP細(xì)胞中Aβ40水平。同時，阿魏酸顯著升高SH-APP細(xì)胞的細(xì)胞活力，并抑制了細(xì)胞的凋亡。此外，阿魏酸能顯著抑制SH-APP細(xì)胞中tau蛋白Ser 199/202和Ser 396位點的過度磷酸化，這對形成成對的螺旋細(xì)絲至關(guān)重要，初步的作用機(jī)制可能是阿魏酸通過調(diào)節(jié)磷酸化GSK-3β蛋白和抑制促凋亡蛋白如caspase-9的表達(dá)來發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，這與前期報道的阿魏酸通過PI3K/Akt信號傳導(dǎo)激活GSK-3β的結(jié)果一致[3]。

β淀粉樣蛋白積聚是AD的主要病理標(biāo)志之一，Aβ是由β淀粉樣蛋白APP通過β和γ分泌酶分泌淀粉樣蛋白生成途徑形成的[7-9]。Aβ的積累導(dǎo)致神經(jīng)元損傷和穩(wěn)定性下降、惡化、突觸抑制、氧化應(yīng)激，神經(jīng)元功能障礙和炎癥[10-12]。FDA于2021年6月7日批準(zhǔn)Biogen的針對淀粉樣β蛋白的單抗aducanumab上市，用于治療AD源性輕度認(rèn)知障礙及輕度AD，這是自2003年以來首個批準(zhǔn)的治療AD的新藥，也是首個能阻止疾病進(jìn)展的藥物[13]。本實驗結(jié)果表明，阿魏酸在0.625～10 μmol·L-1可以有效抑制Aβ40的積累。然而，阿魏酸是否直接影響Aβ的合成尚需進(jìn)一步研究。

在培養(yǎng)的神經(jīng)元中，大量證據(jù)表明Aβ的毒性一部分是通過對多種激酶的激活而引起tau磷酸化的增加來介導(dǎo)的，而GSK-3β是其中關(guān)聯(lián)性最強(qiáng)的一種激酶，被確定為tau發(fā)病的主要激酶[14-15]，在體外和體內(nèi)多個AD相關(guān)位點都能增強(qiáng)tau磷酸化，過表達(dá)GSK-3β的轉(zhuǎn)基因小鼠顯示出tau的蛋白高度磷酸化，微管破壞和神經(jīng)元凋亡[16]。另外，Aβ增強(qiáng)了培養(yǎng)的神經(jīng)元中GSK-3β的活性，阻斷GSK-3β的表達(dá)或活性可抑制Aβ誘導(dǎo)的tau磷酸化和神經(jīng)元凋亡[17]。此外，GSK-3β在神經(jīng)元細(xì)胞死亡，抑制抗凋亡蛋白[例如環(huán)狀A(yù)MP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）]的活性以及增強(qiáng)促凋亡蛋白（例如裂解的caspase-9和caspase-3）中發(fā)揮重要的作用[18-19]。近期研究表明，阿魏酸能通過抑制GSK-3β的磷酸化來保護(hù)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠的心臟組織[19]。本研究也證實了阿魏酸能抑制SH-APP細(xì)胞中GSK-3βY216位點的磷酸化，鑒于有證據(jù)表明磷酸化的tau蛋白可導(dǎo)致微管不穩(wěn)定，軸突運輸受損并最終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡，通常認(rèn)為抑制tau磷酸化可能是治療或預(yù)防AD的有效策略。Western blot 結(jié)果顯示阿魏酸可以顯著降低SH-APP細(xì)胞中tau蛋白Ser 396和Ser 199/202殘基位點的磷酸化，而該殘基位點是GSK-3β的靶標(biāo)，并且與AD腦中的PHF纏結(jié)有關(guān)[20-21]。因此，阿魏酸可以通過激活GSK-3β激酶途徑調(diào)節(jié)tau蛋白上多個AD相關(guān)位點的磷酸化來發(fā)揮抗AD的作用。

APP和早老素基因中的一些突變與Aβ產(chǎn)生的增強(qiáng)有關(guān)[22]，并且與細(xì)胞死亡的易感性增加有關(guān)[23]。此外，APP也是caspase-3剪切的底物，幾項研究表明，caspase介導(dǎo)的APP剪切改變了其正常的蛋白水解過程，從而促進(jìn)了淀粉樣蛋白生成途徑，提示caspase-3介導(dǎo)了APP毒性片段的擴(kuò)大[23-25]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)阿魏酸能抑制SH-APP細(xì)胞中的caspase-3/7活性。同時，流式細(xì)胞檢測也證實了阿魏酸具有抗細(xì)胞凋亡作用。此外，阿魏酸處理能使SH-APP細(xì)胞中剪切的caspase-9的表達(dá)下調(diào)，這些結(jié)果與先前的研究一致，即阿魏酸可以降低caspase介導(dǎo)的APP的異常剪切，并且降低多種AD模型中的細(xì)胞凋亡率，從而發(fā)揮抗AD的作用。

Morris 水迷宮可檢測嚙齒類動物空間學(xué)習(xí)和空間記憶能力，是學(xué)習(xí)記憶方面最為經(jīng)典的實驗方法，在AD 的研究中應(yīng)用較為廣泛[26]。在本次定位航行實驗中，AD模型組的逃避潛伏期均比假手術(shù)組及正常組長，而阿魏酸給藥后大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力得到提高。其次，在空間探索實驗中，也得到類似結(jié)果，提示阿魏酸對Aβ誘導(dǎo)的AD大鼠在Morris水迷宮中的行為學(xué)方面是有明顯保護(hù)作用的。

綜上所述，阿魏酸在體外建立的APP過表達(dá)的AD細(xì)胞模型中具有顯著的抗AD作用，且能顯著改善Aβ所致AD模型大鼠行為學(xué)特征，可能在治療這種復(fù)雜的神經(jīng)退行性疾病中具有一定的優(yōu)勢，成為AD治療中具有價值的候選藥物。