陳旭，周游，劉琳，王冬雪（哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，哈爾濱 150010）

據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟統(tǒng)計(jì)，2021年全球20～ 79歲人群的糖尿病患病率高達(dá)10.5%（5.366億人），保守預(yù)測到2045年其發(fā)病率將上升至12.2%[1]。糖尿病發(fā)病過程中會(huì)引起不同程度的認(rèn)知損害[2]，腦脊液中的主要生物標(biāo)志物如β-淀粉樣蛋白（amyloidβ-protein，Aβ）、tau蛋白、乙酰膽堿（acetylcholine，Ach）等[3-4]，參與機(jī)體眾多的生理功能，與認(rèn)知障礙的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5]。本文通過改良小腦延髓池穿刺法對糖尿病大鼠腦脊液進(jìn)行連續(xù)采集，測定腦脊液中Aβ42、p-tau、Ach的含量，為明確黃連-干姜的藥物作用提供基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

雄性Wistar大鼠60只，8～10周齡，體質(zhì)量（200±20）g [北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（京）2012-0001]。動(dòng)物分組分籠飼養(yǎng)于 12 h明暗交替的環(huán)境中，溫度為 18～21℃，相對濕度為（50±5）%。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)期間可自由攝食、飲水。

1.2 試藥

黃連、干姜（哈爾濱世一堂藥材公司），經(jīng)哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥用植物教研室張德連教授鑒定分別為毛茛科植物黃連（Coptis chinensisFranch.）的干燥根莖、姜科植物姜（Zingiber officinale Rosc．）的干燥根莖；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ，北京博愛科貿(mào)有限公司Sigma分裝，批號：S0130）；葡萄糖測定試劑盒（長春匯力，批號：050411）；鹽酸二甲雙胍片（澳大利亞艾華大藥廠，批號：A108R，規(guī)格：每片含鹽酸二甲雙胍0.5 g）；Ra Ach ELISA 試劑盒、Ra Aβ42 ELISA 試劑盒、Ra p-tau ELISA 試劑盒[上海藍(lán)基（BG）生物科技有限公司]。

1.3 儀器

一次性使用靜脈輸液針（江西洪達(dá)醫(yī)療器械集團(tuán)有限公司）；標(biāo)準(zhǔn)型單臂腦立體定位儀（型號68001，深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；酶標(biāo)分析儀（型號RT-6000，RAYTO公司）。

2 方法

2.1 模型復(fù)制

2.1.1 緩沖液的配制 A液：2.10 g檸檬酸（分子量210.14）溶于100 mL無菌注射用水，配制成0.1 mol·L-1檸檬酸溶液；B液：2.94 g檸檬酸鈉（分子量294.10）溶于100 mL無菌注射用水，配制成0.1 mol·L-1檸檬酸鈉溶液；取A液57 mL、B液43 mL（按1∶1.32），將兩者混合，測定pH值，調(diào)節(jié)pH值為4.2～4.5，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，置于4℃冰箱備用。

2.1.2 腹腔注射STZ溶液 動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，禁食不禁水16 h，以冰緩沖液將STZ粉末溶解，避光操作，配制1%的 STZ溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。模型組按照給藥劑量55 mg·kg-1腹腔注射，冰上避光操作，15 min內(nèi)注射完畢；對照組腹腔注射相同劑量緩沖液。注射STZ 72 h后檢測血糖，選擇空腹血糖≥16.7 mmol·L-1的動(dòng)物納入實(shí)驗(yàn)。

2.2 分組與給藥

2.2.1 藥液制備 黃連-干姜水煎液：取黃連、干姜（質(zhì)量比2∶1）加水浸泡30～45 min，煎煮兩次，合并濾液（按黃連計(jì)，10 g·mL-1），放入4℃冰箱中備用，在7 d內(nèi)使用。

二甲雙胍藥液制備：鹽酸二甲雙胍片劑研成細(xì)粉，用蒸餾水配制成質(zhì)量濃度為3.76 mg·mL-1的溶液，4℃保存，在3 d內(nèi)使用。灌胃前將藥液放至常溫后使用。

2.2.2 動(dòng)物分組 模型組大鼠依據(jù)血糖隨機(jī)分為模型組（n＝12）、黃連-干姜組（n＝12）、二甲雙胍組（n＝11）和對照組（n＝10）。對照組與模型組以蒸餾水灌胃；黃連-干姜組給予黃連-干姜水煎液，每日給藥劑量為2.24 g·kg-1；二甲雙胍組給予3.76 mg·mL-1二甲雙胍藥液，每日給藥劑量為75.20 mg·kg-1，給藥容積均為1 mL/100 g。以上各組每日灌胃兩次，給藥75 d。

2.3 空腹血糖測定

實(shí)驗(yàn)前更換墊料，禁食16 h，自由飲水。大鼠乙醚麻醉，眼底靜脈叢取血0.5 mL，肝素抗凝，離心（3000 r·min-1，10 min），吸取上清液，采用葡萄糖氧化法測定血糖，按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2.4 酶聯(lián)免疫吸附法測定大鼠腦脊液中主要生物標(biāo)志物

2.4.1 人工腦脊液的配制 準(zhǔn)確稱取NaCl 7.247 g，KCl 0.373 g，MgSO4·7H2O 0.493 g，KH2PO40.174 g，NaHCO32.184 g，混合定容至100 mL，即為母液（10×）。取母液10 mL，加入葡萄糖粉0.198 g，充分溶解，再加入1 mol·L-1CaCl20.2 mL（去離子水配制），去離子水定容至100 mL，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，置于4℃冰箱備用。

2.4.2 大鼠腦脊液采集 大鼠采用腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉（給藥劑量為45 mg·kg-1，給藥容積為0.15 mL/100 g），備皮，將其固定于腦立體定位儀上，保證操作臺水平，兩側(cè)耳桿在同一直線，門齒桿較耳桿低0.33 cm。維持體溫37℃，皮膚消毒。頸后部縱切口（1～1.5 cm），鈍性分離肌肉，擴(kuò)大視野。干棉球按壓止血，保持術(shù)口清晰，鈍性分離肌肉暴露至寰枕膜。采用一次性靜脈輸液針（針斜面向上）緩慢水平刺入至小腦延髓池，另端連接好1 mL注射器，緩慢收集腦脊液。針尖完全進(jìn)入后即可直接抽取腦脊液，若未見腦脊液流出，可輕微旋轉(zhuǎn)針體。

腦脊液能夠抽出并且澄清、無血為采集成功。穿刺成功者，收集腦脊液后，注入等量的消毒人工腦脊液，以保持原來腦脊髓腔的壓力。術(shù)畢，逐層縫合，將少許青霉素粉末灑至傷口處。術(shù)后，動(dòng)物單籠飼養(yǎng)，每日傷口消毒兩次，肌內(nèi)注射80 000 u·d-1青霉素，連續(xù)3 d。大鼠恢復(fù)5～7 d后，如愈合良好并且適應(yīng)環(huán)境后即可用于拆線合籠。操作示意如圖1。

圖1 大鼠小腦延髓池Fig 1 Cerebellomedullary cistern of rat

2.4.3 大鼠腦脊液中Aβ42、Ach、p-tau動(dòng)態(tài)變化的測定 依試劑盒說明書進(jìn)行操作，用酶標(biāo)儀于相應(yīng)波長下測定吸光度，計(jì)算各組大鼠腦脊液中Aβ42、Ach、p-tau的含量。

2.5 大鼠腦組織中Aβ42的測定

大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉（劑量45 mg·kg-1）進(jìn)行麻醉，隨后斷頭剝離腦組織。依試劑盒要求處理樣本，并進(jìn)行顯色，用酶標(biāo)儀于相應(yīng)波長下測定吸光度，計(jì)算各組大鼠腦組織中Aβ42的含量。

2.6 統(tǒng)計(jì)方法

應(yīng)用SPSS 21.0 For Windows 統(tǒng)計(jì)軟件中方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)資料處理，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，三組及以上組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。P＜0.05說明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 黃連-干姜對糖尿病大鼠空腹血糖的影響

與空白組比較，模型組大鼠空腹血糖均升高（P＜0.01）；與模型組比較，黃連-干姜組用藥60、75 d時(shí)空腹血糖顯著降低（P＜0.05），二甲雙胍組用藥60、75 d時(shí)空腹血糖顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見圖2A。

3.2 黃連-干姜對糖尿病大鼠腦脊液Aβ42、Ach、p-tau 動(dòng)態(tài)變化的影響

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠腦脊液中Aβ42含量不斷下降，與空白組比較，在用藥30 d時(shí)含量顯著下降（P＜0.01）；而黃連-干姜對此變化趨勢具有調(diào)節(jié)作用，與模型組比較，黃連-干姜組大鼠在用藥30、60、75 d腦脊液中 Aβ42含量顯著升高（P＜0.05 或P＜0.01），二甲雙胍組大鼠在用藥 30 d時(shí)腦脊液 Aβ42顯著升高（P＜0.05），結(jié)果見圖2B?？瞻捉M和模型組大鼠腦脊液中 Ach 用藥前未出現(xiàn)差異，與空白組比較，模型組大鼠在用藥30、60、75 d Ach含量均較低（P＜0.05 或P＜0.01）；而黃連-干姜對此變化趨勢具有調(diào)節(jié)作用，與模型組比較，黃連-干姜組大鼠腦脊液中Ach含量在用藥30 d時(shí)顯著升高（P＜0.01）；二甲雙胍組對腦脊液中Ach含量的調(diào)節(jié)作用不明顯，結(jié)果見圖2C。與空白組比較，模型組大鼠腦脊液p-tau含量在用藥60、75 d時(shí)顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，黃連-干姜組和二甲雙胍組在用藥30 d后，有一定的改善作用，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見圖2D。

圖2 黃連-干姜對糖尿病大鼠空腹血糖及腦脊液Aβ42、Ach、p-tau的影響Fig 2 Effect of Coptis-dried ginger on FBG，Aβ42，Ach，and p-tau in diabetic rats

3.3 黃連-干姜對糖尿病大鼠腦組織Aβ42的影響

與空白組比較，模型組大鼠造模75 d各腦組織中Aβ42含量增加（P＜0.05）；與模型組比較，黃連-干姜組腦內(nèi)Aβ42水平顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見圖3。

圖3 黃連-干姜對糖尿病大鼠腦組織Aβ42的影響（n＝7）Fig 3 Effect of Coptis-dried ginger on brain Aβ42 in diabetic rats（n＝7）

4 討論

腦脊液被視為腦內(nèi)傳輸媒體，被廣泛用于臨床研究，通過對腦脊液中各成分的分析，可動(dòng)態(tài)觀察藥物對該模型的影響[6]。采集實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腦脊液的方法大致分為兩類：其一是側(cè)腦室穿刺法，在動(dòng)物顱骨表面鉆孔插管引流腦脊液[7]；其二是穿刺進(jìn)入小腦延髓池抽取腦脊液的方法[8]。由于大鼠的腦室及蛛網(wǎng)膜下腔狹小，側(cè)腦室穿刺法在采集時(shí)所需時(shí)間過長，腦脊液標(biāo)本采集困難，且穿刺過程中要穿過腦組織，故此法易造成腦組織損傷和出血，失敗率非常高[9]。據(jù)報(bào)道，體質(zhì)量300 g的大鼠腦脊液總體積大約580 μL，可以被抽出的腦脊液更少，故采集到足量的腦脊液用于分析是一個(gè)關(guān)鍵，采用靜脈輸液針行小腦延髓池的方法可以采集約120 μL用于檢測。實(shí)驗(yàn)前期研究比較了靜脈輸液針穿刺法、微量注射器穿刺法、毛細(xì)玻管穿刺法進(jìn)行大鼠小腦延髓池穿刺連續(xù)采集腦脊液的效果，發(fā)現(xiàn)靜脈輸液針穿刺法具有以下優(yōu)點(diǎn)：① 可以更精確地控制采集時(shí)腦脊液的取得量；② 因針頭帶針柄，在腦脊液采集過程中比較容易固定，利于采集；③ 針頭較細(xì)，在刺破硬腦膜時(shí)腦脊液溢出量很少，且有利于第二次抽取；④ 可以減少殘余在抽取器械內(nèi)壁上腦脊液的量，避免浪費(fèi)；⑤ 內(nèi)徑較小，便于控制抽取速度，可以將抽取速度精確地控制在50 μL·min-1左右。本實(shí)驗(yàn)采用一次性靜脈輸液針進(jìn)行小腦延髓池穿刺連續(xù)采集大鼠腦脊液，連續(xù)采集5次以上動(dòng)物占54.3%，連續(xù)采集4次以上動(dòng)物占80.0%，腦脊液采集量均在120 μL以上，可以保證腦脊液相關(guān)指標(biāo)的動(dòng)態(tài)分析。但在長期飼養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，此腦脊液采集方法仍存在一定的術(shù)后感染風(fēng)險(xiǎn)，受飼養(yǎng)環(huán)境影響而導(dǎo)致動(dòng)物死亡，因此，在后面的研究中可以致力于非手術(shù)性采集方法的發(fā)掘。

糖尿病發(fā)病率逐年攀升，其引起的認(rèn)知損害也廣泛受到關(guān)注，現(xiàn)普遍認(rèn)為其與阿爾茨海默病（AD）有密切聯(lián)系，前期研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病模型大鼠90 d內(nèi)出現(xiàn)明顯學(xué)習(xí)記憶損害[10]，Aβ沉積是其核心病理特征之一。Aβ具有明顯的神經(jīng)毒性，可引起炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等進(jìn)一步損害突觸可塑性、膽堿等神經(jīng)系統(tǒng)功能等，腦脊液中Aβ42的水平，可反映構(gòu)成老年斑的核心成分纖維狀A(yù)β的含量，且Aβ沉積一般發(fā)生在AD早期。tau蛋白的過度磷酸化會(huì)降低微管的穩(wěn)定，使微管解聚，從而形成神經(jīng)元纖維纏結(jié)[11]。Ach作為一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)提高腦內(nèi)Ach的含量能夠修復(fù)AD患者損傷的膽堿能功能[12]，組織神經(jīng)元間Ach的代謝對提高學(xué)習(xí)、記憶關(guān)系重大[13]。本實(shí)驗(yàn)自模型建立起，每隔15 d采集大鼠腦脊液，發(fā)現(xiàn)大鼠腦脊液中Aβ42自15 d開始降低，至30 d降到最低，與空白組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而后緩慢升高。根據(jù)結(jié)果分析，在模型建立初期，血糖的劇烈升高可能引起了體內(nèi)Aβ42的糖化現(xiàn)象。臨床上，腦脊液中Aβ42的降低可能意味著腦內(nèi)發(fā)生Aβ沉積，在實(shí)驗(yàn)最后對腦組織內(nèi)的Aβ42的測定結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)。此外，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著病程發(fā)展，糖尿病大鼠腦脊液中p-tau持續(xù)升高，與空白組相比，在給藥60、75 d差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。究其原因，可能與糖尿病引起的胰島素抵抗現(xiàn)象導(dǎo)致的PI3K途徑的GSK-3的活化相關(guān)，有待進(jìn)一步考證。與空白組比較，糖尿病大鼠腦脊液中Ach含量呈下降趨勢，經(jīng)過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，Ach變化與Aβ42、p-tau變化成負(fù)相關(guān)（r＝-0.916），提示糖尿病大鼠腦脊液中Ach的變化由Aβ42、p-tau的變化共同決定，且由前述分析可知，模型建立0～30 d時(shí)，p-tau的變化不明顯，此時(shí)Aβ42的變化是Ach的變化的主要影響因素，故在藥物干預(yù)時(shí)，應(yīng)選擇能夠在早期控制血糖、糾正腦脊液中Aβ42降低的藥物，以減少認(rèn)知損害。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了黃連-干姜具有較好的降低糖尿病大鼠空腹血糖的作用，接近于二甲雙胍的作用，且在給藥60、75 d時(shí)作用明顯。模型組大鼠腦脊液Aβ42呈現(xiàn)先降低后緩慢升高趨勢，二甲雙胍組大鼠變化趨勢同模型組，與模型組大鼠比較，黃連-干姜能夠升高30、60、75 d腦脊液中Aβ42的含量；模型建立75 d后，黃連-干姜能夠降低腦組織內(nèi)Aβ42含量，黃連-干姜具有降低60、75 d腦脊液中p-tau蛋白的趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；黃連-干姜能夠提高給藥30、60、75 d腦脊液中Ach含量。通過對黃連-干姜對糖尿病干預(yù)作用的初步研究，表明其可改善糖尿病大鼠空腹血糖，降低腦組織中Aβ42含量，提高腦脊液中Aβ42、Ach含量。

歷代本草記載，黃連苦寒無毒，神農(nóng)本草經(jīng)歸為上品，僅《傷寒雜病論》中含有黃連的方劑就有14個(gè)[14]。小檗堿為黃連中的主要有效成分之一，研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿能夠通過改善腦血流量，保護(hù)神經(jīng)元免受炎癥，限制tau的高磷酸化等多種機(jī)制妨礙AD的發(fā)展。同時(shí)，小檗堿對糖尿病和相關(guān)疾病有效，例如動(dòng)脈粥樣硬化、心肌病、高血壓、肝臟脂肪病、糖尿病腎病、腸道脫敏和神經(jīng)病變等，表明其有預(yù)防認(rèn)知障礙的間接益處[15]。此外，有研究報(bào)道采用小檗堿聯(lián)合二甲雙胍進(jìn)行口服給藥對db/db小鼠糖尿病發(fā)展過程中引起的認(rèn)知功能障礙有改善作用，且比單獨(dú)給藥二甲雙胍效果更明顯，其作用機(jī)制可能與抗炎、抗氧化應(yīng)激以及提高興奮性氨基酸水平等相關(guān)[16]。但前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，單用黃連可導(dǎo)致糖尿病動(dòng)物出現(xiàn)攝食減少，精神狀態(tài)萎靡，毛色枯槁，爪甲變白，畏寒扎堆。死亡動(dòng)物臟器檢查主要表現(xiàn)為各腸段脹氣較明顯，胃部脹大，腸壁變薄，腹部脹氣嚴(yán)重，內(nèi)部有食物殘留，其余臟器均未發(fā)現(xiàn)明顯病變，據(jù)此推測，糖尿病動(dòng)物可能由于單用黃連導(dǎo)致胃腸反應(yīng)而死亡。且研究發(fā)現(xiàn)干姜配伍黃連能夠促進(jìn)小檗堿等黃連中主要生物堿的吸收[17]，故本研究選擇具有辛溫之性的藥物干姜溫?zé)嵫a(bǔ)虛，同時(shí)制約黃連之苦寒，藥物搭配寒熱并用、升降相因、切合病機(jī)[18]。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，黃連-干姜可改善糖尿病大鼠空腹血糖，降低腦組織中Aβ42含量，提高腦脊液中Aβ42、Ach含量。據(jù)報(bào)道，黃連-干姜主要是針對糖尿病初期的陰虛熱盛階段，而根據(jù)臨床糖尿病中、晚期患者以氣陰兩虛為主，糖尿病認(rèn)知功能損害患者臨床以氣陰兩虛夾痰證多見[19]，因此后續(xù)研究應(yīng)確立糖尿病認(rèn)知損害中藥預(yù)防性干預(yù)的用藥原則、干預(yù)最佳時(shí)間窗。另外，應(yīng)進(jìn)一步探究黃連-干姜影響糖尿病大鼠腦脊液Aβ42、Ach、p-tau水平的機(jī)制，為闡明藥物作用機(jī)制提供基礎(chǔ)。