付慧敏，喬子桐，張純剛*，郭勇，程嵐*（.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 660；.神威藥業(yè)集團有限公司，石家莊 05430）

軟膠囊劑型的出現(xiàn)，無疑從穩(wěn)定性、精準(zhǔn)劑量等方面給醫(yī)藥、保健品及功能食品行業(yè)帶來了革命性的變革[1]。然而在生產(chǎn)和儲存環(huán)節(jié)，軟膠囊也會面臨一些挑戰(zhàn)，比如高溫高濕的保存條件；藥物活性成分或營養(yǎng)產(chǎn)品中含有醛類；內(nèi)容物較為復(fù)雜（如復(fù)合維生素、多種礦物質(zhì)、金屬離子或是以上成分的混合物等）[2-3]，這些因素可能會使軟膠囊囊殼材料-明膠發(fā)生交聯(lián)而產(chǎn)生對軟膠囊穩(wěn)定的負面影響。雖然許多研究工作者試圖利用其他材料來替代明膠，但目前，軟膠囊的生產(chǎn)主要采用旋轉(zhuǎn)沖模法，這就要求非明膠替代材料具有與明膠極為相似的凝膠特性[4]，至今仍沒有一種物質(zhì)可以完全替代明膠，就我國目前的國情而言，以明膠作為軟膠囊囊殼材料的現(xiàn)狀短期內(nèi)不會改變，所以研究能夠延緩老化、生產(chǎn)適用性好的明膠是當(dāng)務(wù)之急。

氨基是明膠發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)的主要結(jié)合位點[5]，本試驗在不替換軟膠囊囊殼主要成分——明膠的基礎(chǔ)上，對明膠進行改性，通過琥珀酸酐與明膠中的氨基的反應(yīng)，增加氨基封閉率，降低明膠中游離氨基含量，從而減少明膠軟膠囊的交聯(lián)現(xiàn)象，改善軟膠囊劑型的穩(wěn)定性，以期開發(fā)安全有效、工藝簡單、質(zhì)量可控的軟膠囊以適應(yīng)臨床治療需要。

1 材料

1.1 試藥

琥珀酸酐、氫氧化鈉（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；明膠、巧克力棕、莧菜紅、甘油（神威藥業(yè)集團有限公司）；鹽酸[利安隆博華（天津）醫(yī)藥化學(xué)有限公司]；甲醛（丹東市龍海試劑廠）；純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）。

1.2 儀器

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；FA1004精密電子天平（天津天馬衡基儀器有限公司）；pHS-25型試驗室pH計（上海今邁儀器儀表公司）；JK-BJ-II崩解時限儀（上海精學(xué)科學(xué)儀器有限公司）；CT3質(zhì)構(gòu)儀（美國博勒飛公司）；WGLL-230BE電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；數(shù)顯千分測厚規(guī)（浙江德清盛泰芯電子科技有限公司）；透析袋MD44（北京索萊寶科技有限公司）。

2 方法

2.1 改性明膠的制備

精密稱取20.00 g明膠置于500 mL燒杯中，加入100 mL純凈水，在45℃下攪拌溶解，160 r·min-1攪拌1 h。隨后將一定劑量的琥珀酸酐在攪拌下逐步加入到明膠溶液中，繼續(xù)攪拌1 h，同時用1 mol·L-1氫氧化鈉溶液維持反應(yīng)體系的pH在9～10。待兩者完全反應(yīng)，用1 mol·L-1鹽酸溶液調(diào)節(jié)膠液的pH至6。將改性明膠溶液移入透析袋，在蒸餾水中透析36 h，取出，于40℃下鼓風(fēng)干燥，得到改性明膠。

2.2 明膠膠片的制備

精密稱取純凈水、濃縮色素溶液和處方量的甘油投入燒杯中，160 r·min-1攪拌均勻，加熱至70℃，待30 min后加入明膠，繼續(xù)攪拌1 h，至膠液無氣泡，趁熱倒入寬為100 mm的方形培養(yǎng)皿內(nèi)，冷卻至室溫。于30℃溫度下鼓風(fēng)干燥6 h，揭下，得到厚度約為0.5 mm的膠皮，保存在干燥器中，待用。

2.3 囊殼評價指標(biāo)的測定方法

2.3.1 甲醛處理后崩解時間的測定 制備不同質(zhì)量濃度的甲醛溶液，將大小為20 mm×15 mm×0.5 mm的未改性方形膠片在甲醛溶液內(nèi)放置15 min后取出擦干，參照《中國藥典》2020年版第四部0921崩解時限檢查法對膠片崩解時限進行測定[6]。平行測定3次，取平均值，甲醛質(zhì)量濃度為0、5.55、11.1、16.65、22.2、27.75、33.3、38.85、44.4、49.95 mg·mL-1時的崩解時間分別為1 min 14 s、3 min 24 s、5 min 15 s、12 min 43 s、29 min 15 s、59 min 7 s、80 min 32 s、105 min 53 s、＞2 h、＞2 h。最終選擇未改性膠片崩解時限超過2 h的44.4 mg·mL-1甲醛作為囊殼甲醛處理后崩解時間評價指標(biāo)的處理濃度。

2.3.2 彈性模量的測定 將厚度均勻、完整的膠片裁剪成長條，寬為4 mm，工作部分長度為3 mm，兩端分別夾在質(zhì)構(gòu)儀的上下拉伸探頭DGF上，設(shè)定相應(yīng)參數(shù)，拉伸速度l.5 mm·s-1，在質(zhì)構(gòu)儀上定速拉伸，直至膠片被拉斷，得到拉伸過程的應(yīng)力應(yīng)變曲線，彈性階段的應(yīng)力與應(yīng)變的比值即為彈性模量，單位為N·mm-2，平行3次試驗，取平均值（注：在進行力學(xué)性能測試之前，要先將膠片在室溫、35%相對濕度環(huán)境下放置24 h）。

2.3.3 硬度的測定 將厚度均勻、完整的膠片裁剪為大小為15 mm×15 mm×0.5 mm的方形膠片，固定在質(zhì)構(gòu)儀的菲林夾具FSF上，使用直徑為0.1 cm的穿刺探頭以1.5 mm·s-1的速度向膠片進行穿刺試驗，直至膠片被刺破，得到負荷與距離變化曲線，曲線的峰值代表膠皮的硬度，單位為g。平行3次試驗，取平均值（注：在進行力學(xué)性能測試之前，要先將膠片在室溫、35%相對濕度環(huán)境下放置24 h）。

2.4 單因素試驗設(shè)計

在預(yù)試驗的基礎(chǔ)上，分別探討改性劑琥珀酸酐添加量，甘油添加量，膠液pH對改性明膠膠片甲醛處理后崩解時間、膠片彈性模量、硬度的影響。

2.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用Design-Expert 8軟件的Box-Behnken試驗設(shè)計原理，以明膠膠片甲醛處理后崩解時間、膠片彈性模量、硬度響應(yīng)值作為考察指標(biāo)，進行三因素三水平試驗，試驗因素水平編碼見表1。通過數(shù)據(jù)分析，建立數(shù)學(xué)回歸模型，預(yù)測響應(yīng)值，確定改性明膠膠片配方的最優(yōu)條件。

表1 響應(yīng)面因素與水平 Tab 1 Factor and level for response surface

2.6 數(shù)據(jù)分析

由于膠片甲醛處理后崩解時間越短越好，膠片彈性模量和硬度越接近初始制備的明膠膠片的力學(xué)性能指標(biāo)越好（按照明膠-甘油-水為1∶5.2∶4的比例制作明膠膠片，進行膠片的拉伸和穿刺試驗，確定軟膠囊囊殼的最佳力學(xué)性能數(shù)據(jù)：y彈性模量佳＝14.16 N·mm-2，y硬度佳＝1950.75 g），故以各指標(biāo)的最佳值為參照將數(shù)據(jù)進行歸一化，獲得響應(yīng)值a，b，c，各個指標(biāo)響應(yīng)值公式如下：

甲醛處理后崩解時間響應(yīng)值a＝y(tǒng)min/yi

彈性模量響應(yīng)值b＝y(tǒng)佳/（y佳＋│yi-y佳│）

硬度響應(yīng)值c＝y(tǒng)佳/（y佳＋│yi-y佳│）

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗結(jié)果

3.1.1 改性劑添加量對改性明膠膠片的影響 改性劑添加量對改性明膠膠片的影響見圖1。隨著改性劑添加量的增多，改性明膠中可與甲醛發(fā)生“希夫堿”反應(yīng)[7]的游離氨基的含量減少，改性膠片的甲醛處理后崩解時間有不同程度的降低。且隨著改性劑添加量的增大，改性膠片的彈性模量、硬度均有所下降，這可能是由于氨基的封閉導(dǎo)致明膠凈負電荷增加，減弱了明膠分子因氨基和羰基之間的引力而聚集的程度，使分子在改性明膠-水-甘油復(fù)合物中形成了較弱的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[8-9]。

圖1 改性劑添加量對明膠膠片甲醛處理后崩解時間、彈性模量和硬度的影響Fig 1 Influence of modifier dosage on the disintegration time，elastic modulus and hardness of gelatin film after formaldehyde treatment

3.1.2 甘油添加量對改性明膠膠片的影響 甘油添加量對改性明膠膠片的影響見圖2。隨著甘油添加量的增加，甘油大量插入明膠大分子鏈間，明膠的羥基、氨基、羧基形成分子間氫鍵，削弱大分子鏈間以及分子內(nèi)的相互作用，增大了大分子鏈的移動性[10]，導(dǎo)致改性明膠膠片的硬度、彈性模量呈現(xiàn)規(guī)律性下降。當(dāng)甘油添加量在30%～40%時，可保證改性明膠與市售明膠膠片力學(xué)性能相近。甘油添加量對甲醛處理后改性明膠膠片崩解時間的影響差距不明顯。

圖2 甘油添加量對明膠膠片甲醛處理后崩解時間、彈性模量和硬度的影響Fig 2 Effect of glycerol content on the disintegration time，elastic modulus and hardness of gelatin film after formaldehyde treatment

3.1.3 膠液pH對改性明膠膠片的影響 膠液pH對改性明膠膠片的影響見圖3。明膠分子中的氨基和羧基在過酸條件（即低pH環(huán)境）下所帶電荷下降，明膠分子間的氨基和羧基的吸引力弱[11]，導(dǎo)致改性明膠膠片的硬度、彈性模量呈現(xiàn)規(guī)律性下降，這與羅錦杰[12]的研究結(jié)果一致。膠液pH對甲醛處理后改性明膠膠片崩解時間的影響差距不明顯。

圖3 膠液pH對明膠膠片甲醛處理后崩解時間、彈性模量和硬度的影響Fig 3 Effect of pH on the disintegration time，elastic modulus and hardness of gelatin film after formaldehyde treatment

3.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果

3.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果 在單因素試驗基礎(chǔ)上，利用Design-ExpertV 8.0.6軟件中Box-Behnken響應(yīng)面分析法進行設(shè)計。試驗設(shè)置17個試驗（析因試驗12個，中心試驗5個），用以分析試驗誤差。選取改性劑添加量（A），甘油添加量（B），膠液pH（C）作為自變量，將膠片甲醛處理后崩解時間、膠片彈性模量、硬度歸一化后作為響應(yīng)值，進行響應(yīng)面分析，詳見表2。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果 Tab 2 Response surface test design and results

3.2.2 回歸模型的建立和方差分析 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以甲醛處理后崩解時間歸一值為響應(yīng)值進行優(yōu)化試驗。利用Design-ExpertV 8.0.6軟件對表2數(shù)據(jù)進行分析，得到各因素與響應(yīng)值之間的多元二次回歸模型：a＝0.86＋0.25A-0.051B＋0.15C-1.500×10-3AB＋0.21AC-0.095BC-0.35A2-0.038B2-0.15C2。回歸模型F＝22.92，P＝0.0002，說明本法可靠。表3中，失擬項P＝0.3841＞0.05，表明該方程對試驗擬合情況好，試驗誤差小，失擬項模型選擇合適；R2＝0.9672，R2Adj＝0.9250，說明試驗結(jié)果有92.50%受試驗因素影響，模型試驗誤差小，試驗預(yù)測值與實際值擬合較好。

表3 響應(yīng)值a回歸模型的方差分析結(jié)果 Tab 3 Variance analysis of response value a regression model

由表3可知，模型的一次項A、C，二次項AC、A2、C2對甲醛處理后崩解時間響應(yīng)值影響極顯著（P＜0.01），各因素對甲醛處理后崩解時間響應(yīng)值的影響依次為A＞C＞B。各因素交互作用對甲醛處理后崩解時間響應(yīng)值影響的響應(yīng)面圖和等高線圖見圖4，結(jié)合表3可知，AC交互作用對甲醛處理后崩解時間響應(yīng)值影響極顯著（P＜0.01），其他因素間的交互作用不顯著。

圖4 各因素交互作用對甲醛處理后崩解時間的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig 4 Response surface plot and contour plot of interaction of various factors on disintegration time after formaldehyde treatment

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以彈性模量歸一值為響應(yīng)值進行優(yōu)化試驗。利用Design-ExpertV 8.0.6軟件對表2數(shù)據(jù)進行分析，得到各因素與響應(yīng)值之間的多元二次回歸模型：b＝0.95-4.375×10-3A＋0.022B-0.046C-0.15AB＋0.12AC＋0.11BC-0.071A2-0.15B2-0.17C2?；貧w模型F＝40.60，P＜0.0001，說明本法可靠。表4中，失擬項P＝0.4741＞0.05，表明該方程對試驗擬合情況好，試驗誤差小，失擬項模型選擇合適；R2＝0.9812，R2Adj＝0.9570，說明試驗結(jié)果有95.70%受試驗因素影響，模型試驗誤差小，試驗預(yù)測值與實際值擬合較好。

由表4可知，模型的一次項C，二次項AB、AC、BC、A2、B2、C2對彈性模量響應(yīng)值影響極顯著（P＜0.01）；各因素對彈性模量響應(yīng)值的影響依次為C＞B＞A。各因素交互作用對彈性模量響應(yīng)值影響的響應(yīng)面圖和等高線圖見圖5，結(jié)合表4可知，AB、AC、BC交互作用對彈性模量響應(yīng)值影響均極顯著（P＜0.01）。

表4 響應(yīng)值b回歸模型的方差分析結(jié)果 Tab 4 Variance analysis of response value b regression model

圖5 各因素交互作用對膠片彈性模量的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig 5 Response surface plot and contour plot of interaction of various factors on elastic modulus of film

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以硬度歸一值為響應(yīng)值進行優(yōu)化試驗。利用Design-ExpertV 8.0.6軟件對表2數(shù)據(jù)進行分析，得到各因素與響應(yīng)值之間的多元二次回歸模型：c＝0.96-0.024A＋0.034B＋0.025C-0.088AB＋0.097AC＋0.11BC-0.062A2-0.10B2-0.12C2?；貧w模型F＝18.62，P＝0.0004，說明本法可靠。表5中，失擬項P＝0.1516＞0.05，表明該方程對試驗擬合情況好，試驗誤差小，失擬項模型選擇合適；R2＝0.9599，R2Adj＝0.9083，說明試驗結(jié)果有90.83%受試驗因素影響，模型試驗誤差小，試驗預(yù)測值與實際值擬合較好。

由表5可知，模型的一次項B，二次項AB、AC、BC、B2、C2、A2對硬度響應(yīng)值影響顯著（P＜0.05），各因素對硬度響應(yīng)值的影響依次為B＞C＞A。各因素交互作用對硬度響應(yīng)值影響的響應(yīng)面圖和等高線圖見圖6，結(jié)合表5可知，AB、AC、BC交互作用對硬度響應(yīng)值影響均極顯著（P＜0.01）。

圖6 各因素交互作用對膠片硬度的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig 6 Response surface plot and contour plot of interaction of various factors on film hardness

表5 響應(yīng)值c回歸模型的方差分析結(jié)果 Tab 5 Variance analysis of response value c regression model

3.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化及驗證 得到改性明膠囊殼的最佳理論條件為：酸酐添加量為明膠的5.51%，甘油添加量為明膠的35.10%，膠液pH為5.21。在此條件下預(yù)測的響應(yīng)值分別為a＝0.940，b＝0.935，c＝0.959。結(jié)合實際生產(chǎn)條件，確定最佳工藝條件為：酸酐添加量為明膠的5.5%，甘油添加量為明膠的35%，膠液pH為5.20。在此條件下進行5次平行驗證試驗，測得甲醛處理后崩解時間為20.00 s，膠片彈性模量為14.64 N·mm-2，硬度為2035.85 g，實際響應(yīng)值分別為a＝0.950，b＝0.967，c＝0.958，與理論預(yù)測值相比，相對誤差分別為1.06%、3.42%、0.10%。接近理論模型預(yù)測值，說明該模型對試驗結(jié)果擬合情況好，誤差小，可以利用響應(yīng)面法對改性明膠囊殼制備工藝進行預(yù)測與分析。未改性膠片與改性膠片實物圖片見圖7。

圖7 未改性膠片（左）與改性膠片（右）實物圖片F(xiàn)ig 7 Physical picture of unmodified（left）and modified（right）film

4 討論

軟膠囊老化現(xiàn)象主要是由囊殼成分明膠發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)引起老化導(dǎo)致的，是明膠分子中的氨基酸（主要是賴氨酸和精氨酸）自氧化交聯(lián)和外界（一般指內(nèi)容物）引入的低分子醛類物質(zhì)交聯(lián)這兩種反應(yīng)綜合作用的結(jié)果，后者對軟膠囊崩解的影響較大，具體表現(xiàn)為軟膠囊囊殼內(nèi)壁出現(xiàn)一層只能溶脹而不能溶解的膜狀物質(zhì)，導(dǎo)致軟膠囊在儲存期崩解或溶出遲緩，本試驗通過對明膠進行?；男?，減少明膠的交聯(lián)位點，增強了明膠軟膠囊的穩(wěn)定性。為延緩軟膠囊老化研究提供了一種可行的思路與方法，為琥珀酰明膠軟膠囊的制備奠定了理論基礎(chǔ)。