豐晨然，趙一穎，苗豐，董琳琳，暢洪昇，張艷菊，靳鈺媛，尹紀(jì)元，藏晨晨，孫文燕*，王曉玲*（.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥藥理系，北京 0488；.國家兒童醫(yī)學(xué)中心 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院，北京 00045）

過敏性紫癜（Henoch-Schonlein purpura，HSP）是一種侵犯皮膚及其他器官細小動脈和毛細血管的過敏性血管炎。該病臨床自發(fā)性皮膚癥狀在一定程度上是血管性變態(tài)反應(yīng)的外在表現(xiàn)[1]。Arthus反應(yīng)屬于Ⅲ型變態(tài)反應(yīng)，由免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白M（IgM）、免疫球蛋白G（IgG）介導(dǎo)，其形成需抗原的持續(xù)存在；抗原與相應(yīng)的抗體結(jié)合形成免疫復(fù)合物，在一定條件下沉積全身或局部血管壁基底膜、組織間隙，通過激活補體、中性粒細胞或血小板，造成沉積部位炎癥的產(chǎn)生[2]；兔、大鼠、豚鼠均可發(fā)生Arthus反應(yīng)[3]。青紫合劑是北京兒童醫(yī)院院內(nèi)制劑，由“青紫湯”經(jīng)加減化裁而來，具有祛風(fēng)解毒、涼血消斑的功效。方中君藥青黛清熱解毒，涼血消斑；紫草氣味苦寒，而色紫入血，故清理血分之熱。臣藥白芷解表散風(fēng)，通竅止痛，消腫排膿；丹參活血，涼血消癰。佐使藥綿馬貫眾清熱解毒；北寒水石清熱瀉火，利竅消腫；茵陳清熱利濕；威靈仙可祛風(fēng)濕，通經(jīng)絡(luò)。青紫顆粒是青紫合劑經(jīng)改劑型制備的顆粒劑。前期研究表明青紫顆粒對卵蛋白所致大鼠腎損傷有保護作用[4]，本研究通過建立以皮膚為主的HSP模型，探究青紫顆粒對皮膚損害的干預(yù)作用。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF級SD大鼠，4周齡，雌雄各半，雄性體質(zhì)量90～140 g，雌性體質(zhì)量90～115 g [維通利華（北京）實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號為SCXK（京）2016-0006]。普通級日本大耳白兔，雌雄各半，體質(zhì)量1.7～2 kg [昌揚西山養(yǎng)殖場（北京）實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號為SCXK（京）2016-0007]。實驗動物飼養(yǎng)于SPF級動物房，實驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，實驗期間保持環(huán)境相對濕度約為42%，溫度為24℃，光照/黑暗周期為12 h。

1.2 試藥

青紫顆粒（由青黛、紫草、茵陳、丹參、白芷、北寒水石、威靈仙、茵陳、綿馬貫眾組成，北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥制藥系提供，1 g相當(dāng)于生藥2.5 g，4～6歲兒童日用量為37.8 g生藥）；青紫合劑（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院提供，1 mL含生藥0.89 g，2～6歲兒童日用量為53.4 g生藥，批號：20201001）；醋酸地塞米松片（新鄉(xiāng)市常樂制藥有限責(zé)任公司，批號：1911056）；蘆丁片（山西云鵬制藥有限公司，批號：D180702）；卵蛋白（百諾威生物科技有限公司，批號：RH42844）；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑（Sigma，批號：1002749695）；循環(huán)免疫復(fù)合物（CIC）、IgA、IgG、一氧化氮（NO）測定試劑盒及白介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）放免試劑盒（北京華英生物技術(shù)研究所，批號：50087，HY-756，10105，HY-10116，HY-60018）。

1.3 儀器

白光/偏振光/熒光顯微鏡（日本NIKON公司）；掃描儀（3D HISTECH Pannoramic，匈牙利）；激光共聚焦拍照軟件（Eclipse C2，Nikon，Tokyo，日本）；3D掃描分析軟件（3D HISTECH Quant center）；圖像分析軟件（Image-Pro Plus 6.0）；萊卡全自動脫水機（ASP200S）；萊卡自動包埋機（EG1150C）；萊卡半自動石蠟切片機（RM2245）；萊卡自動染色封片工作站（LEICA AUTO STAINER XL）；萊卡脫水機（LEICA ASP300）；全自動放免計數(shù)儀（西安核儀器廠 XH-6020）；全波長酶標(biāo)儀（Bio Tek Epoch）。

2 方法

2.1 青紫顆粒對大鼠Arthus反應(yīng)的干預(yù)作用

2.1.1 模型的建立與分組給藥 SPF級SD大鼠，雌雄各半，隨機分為正常組，模型組，地塞米松組，蘆丁片組，青紫顆粒高、中、低劑量組。參照《藥理實驗方法學(xué)》[5]配制卵蛋白-弗氏不完全佐劑和卵蛋白-弗氏完全佐劑：卵蛋白溶于生理鹽水配制為0.5 g·L-1的溶液，與等量弗氏完全佐劑混懸制成卵蛋白-弗氏完全佐劑，與等量弗氏不完全佐劑混懸制成卵蛋白-弗氏不完全佐劑。

大鼠前3周肌內(nèi)注射卵蛋白-弗氏完全佐劑，后3周注射卵蛋白-弗氏不完全佐劑，每只0.5 mL，每周1次，正常組注射等量生理鹽水。末次致敏當(dāng)日按照正常組，模型組，地塞米松組（0.55 mg·kg-1），蘆丁片組（12.05 mg·kg-1），青紫顆粒高（18.32 g·kg-1）、中（9.16 g·kg-1）、低（4.58 g·kg-1）劑量組給藥，每組12只。按4～6歲兒童臨床用量計算等效劑量。青紫顆粒等效劑量設(shè)為中劑量，2倍量為高劑量，1/2量為低劑量。均灌胃給藥，連續(xù)給藥14 d，正常組、模型組給予等量溶媒。給藥第13日背部備皮，第14日給藥1 h后進行抗原攻擊，于背部皮內(nèi)注射1%卵蛋白溶液（生理鹽水配制），每點注射量為0.2 mL，共3點，正常組于背部皮內(nèi)注射等量的生理鹽水。

2.1.2 皮膚反應(yīng)觀察 抗原攻擊后2、4、6、8、24 h觀察每點局部紅腫斑點的最大直徑，求其平均值。反應(yīng)的程度分級根據(jù)Bena-cerraf氏標(biāo)準(zhǔn)分級[5]：“＋＋＋”表示2 h或5 h明顯充血、出血，呈融合狀，24 h明顯出血性變色；“＋＋”表示2 h或5 h中度充血出血，呈斑塊狀，24 h中度出血性變色；“＋”表示2 h或5 h輕度充血、出血，24 h輕度出血性變色；“-”表示2 h或24 h無反應(yīng)，各組綜合評分為每組樣本平均反應(yīng)程度的平均值。

2.1.3 血清中IgA、IgG、CIC、IL-6、TNF-α、NO的含量檢測 大鼠腹主動脈取血，3000 r·min-1離心10 min，收集血清，-80℃保存。按試劑盒說明書，散射比濁法檢測血清IgA、IgG、CIC含量，放射免疫法檢測血清IL-6、TNF-α含量，硝酸還原酶法檢測血清NO含量。

2.1.4 皮膚組織病理學(xué)觀察 大鼠皮膚10%多聚甲醛固定，石蠟包埋，常規(guī)切片，HE染色，在光鏡下觀察皮膚組織病理學(xué)改變。

2.2 青紫顆粒對兔Arthus反應(yīng)的干預(yù)作用

2.2.1 模型的建立與分組給藥 普通級日本大耳白兔，雌雄各半，隨機分為正常組，模型組，地塞米松組（0.263 mg·kg-1），蘆丁片組（5.78 mg·kg-1），青紫顆粒高（8.79 g·kg-1）、中（4.39 g·kg-1）、低（2.20 g·kg-1）劑量組，青紫合劑組（6.98 mL·kg-1）。參照《藥理實驗方法學(xué)》[5]，將卵蛋白溶于生理鹽水，配制成20 mg·mL-1的卵蛋白溶液，按卵蛋白和弗氏完全佐劑1∶1的比例用注射器雙推法完全乳化。每只兔每周肌內(nèi)注射1 mL卵蛋白-弗氏完全佐劑，正常組注射等量生理鹽水，共4次。末次致敏當(dāng)日按各自劑量給藥。按4～6歲兒童臨床用量計算家兔等效劑量。青紫顆粒等效劑量設(shè)為中劑量，取2倍量為高劑量，1/2量為低劑量。分別灌胃給藥，連續(xù)給藥10 d，正常組與模型組給予等量溶媒。各組于給藥第9日背部備皮，第10日給藥后1 h后進行抗原攻擊，于背部皮內(nèi)注射生理鹽水配制的1%卵蛋白溶液，每點注射量為0.2 mL，共5點，正常組注射等量生理鹽水。

2.2.2 皮膚反應(yīng)觀察 抗原攻擊后2、3、4、5、8、12、24 h觀察每點局部紅腫斑點情況，并測量每個斑點的最大直徑。反應(yīng)的程度分級見“2.1.2”。

2.2.3 兔血清IgA、IgG、CIC檢測 兔心臟取血，3000 r·min-1離心10 min，取血清，按試劑盒說明書采用散射比濁法檢測血清IgA、IgG、CIC的含量。

2.2.4 皮膚組織病理學(xué)觀察 取兔皮膚，用10%多聚甲醛固定，石蠟包埋，沿著斑點直徑切片，HE染色，光鏡下觀察病理改變。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 青紫顆粒對大鼠Arthus反應(yīng)的干預(yù)作用

3.1.1 對Arthus反應(yīng)大鼠背部紅腫斑點直徑、皮膚反應(yīng)程度的影響 抗原攻擊后2 h，各組大鼠背部均未出現(xiàn)紅腫現(xiàn)象?？乖艉? h，青紫顆粒低劑量組、地塞米松組、蘆丁片組大鼠背部斑點直徑小于模型組（P＜0.05或P＜0.01）?？乖艉? h，模型組斑點顏色加深，但局部斑點直徑變小；與模型組相比，青紫顆粒各劑量組紅腫程度降低，地塞米松組、蘆丁片組紅腫直徑明顯小于模型組（P＜0.01）?？乖艉? h，模型組斑點顏色持續(xù)加深，呈中度出血性變色，各組局部斑點直徑增加，地塞米松組、蘆丁片組大鼠斑點直徑小于模型組（P＜0.05或P＜0.01）。抗原攻擊后24 h，模型組呈中度出血性變色，各給藥組呈輕度出血性變色，青紫顆粒中、高劑量組，地塞米松組，蘆丁片組斑點直徑明顯小于模型組（P＜0.05或P＜0.01），結(jié)果見表1。模型組2 h或5 h中度充血、出血，呈斑塊狀；24 h中度出血性變色。各給藥組2 h或5 h輕度充血、出血，24 h輕度出血性變色，反應(yīng)程度等級較模型組低，其中青紫顆粒中劑量組、地塞米松組反應(yīng)程度輕于模型組（P＜0.05）。結(jié)果見表2，24 h皮膚斑點見圖1。

表1 青紫顆粒對Arthus反應(yīng)大鼠局部斑點直徑的影響(±s) Tab 1 Effect of Qingzi granules on the diameter of the swollen spots on the back in the rats with Arthus response (±s)

表1 青紫顆粒對Arthus反應(yīng)大鼠局部斑點直徑的影響(±s) Tab 1 Effect of Qingzi granules on the diameter of the swollen spots on the back in the rats with Arthus response (±s)

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。Note：Compared with the model group，*P＜0.05，**P＜0.01.

組別 n 劑量 2 h 4 h 6 h 8 h 24 h模型組 11 - - 8.04±2.59 7.55±2.58 8.10±2.61 6.33±1.58地塞米松組 11 0.55 mg·kg-1 - 3.64±2.89** 3.22±3.17** 3.10±3.07** 0.57±1.06**蘆丁片組 11 12.05 mg·kg-1 - 2.53±2.54** 2.21±2.60** 2.25±2.55** 1.45±1.37**青紫顆粒高劑量組 11 18.32 g·kg-1 - 7.66±2.53 7.14±3.15 7.25±3.20 2.23±2.06**青紫顆粒中劑量組 11 9.16 g·kg-1 - 6.45±2.16 6.54±2.18 6.20±2.09 3.23±2.44*青紫顆粒低劑量組 11 4.58 g·kg-1 - 4.62±2.13* 4.57±2.88 5.93±2.68 5.66±3.77

表2 青紫顆粒對Arthus反應(yīng)大鼠背部皮膚反應(yīng)程度的影響(±s) Tab 2 Effect of Qingzi granules on the degree of skin reaction in the rats with Arthus response (±s)

表2 青紫顆粒對Arthus反應(yīng)大鼠背部皮膚反應(yīng)程度的影響(±s) Tab 2 Effect of Qingzi granules on the degree of skin reaction in the rats with Arthus response (±s)

注：與正常組比較，▲▲P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05。Note：Compared with the normal group，▲▲P＜0.01；compared with the model group，*P＜0.05.

組別 n 劑量 平均反應(yīng)程度 綜合評分-＋＋＋＋＋＋正常組 12 - 12 0 0 0 0模型組 11 - 0 2 7 2 2.0±0.63▲▲地塞米松組 11 0.55 mg·kg-1 1 9 1 0 1.00±0.45*蘆丁片組 1112.05 mg·kg-1 010 1 0 1.09±0.30青紫顆粒高劑量組1118.32 g·kg-1 0 7 4 0 1.36±0.50青紫顆粒中劑量組11 9.16 g·kg-1 1 9 1 0 1.00±0.45*青紫顆粒低劑量組11 4.58 g·kg-1 0 8 3 0 1.27±0.47

圖1 青紫顆粒對Arthus反應(yīng)大鼠背部皮膚斑點的影響Fig 1 Effect of Qingzi granules on the back swollen spots in the Arthus response rats

3.1.2 對Arthus反應(yīng)大鼠血清IgA、IgG、CIC含量的影響 與正常組相比，模型組血清IgA、IgG、CIC含量顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，青紫顆粒各劑量組、蘆丁片組及地塞米松組血清IgA、IgG含量下降（P＜0.05或P＜0.01），青紫顆粒高、中劑量組，蘆丁片組及地塞米松組血清CIC含量下降（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見圖2。

3.1.3 對Arthus反應(yīng)大鼠血清IL-6、TNF-α、NO水平影響 與正常組相比，模型組血清IL-6、TNF-α、NO含量顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，青紫顆粒高劑量組、蘆丁片組、地塞米松組血清IL-6、TNF-α含量降低（P＜0.05或P＜0.01），青紫顆粒各劑量組、蘆丁片組、地塞米松組血清NO含量顯著降低（P＜0.01）。結(jié)果見圖2。

圖2 青紫顆粒對Arthus反應(yīng)大鼠血清IgA（A）、IgG（B）、CIC（C）、IL-6（D）、TNF-α（E）、NO（F）水平的影響Fig 2 Effect of Qingzi granules on serum IgA（A），IgG（B），CIC（C），IL-6（D），TNF-α（E），NO（F）level in the Arthus response rats

3.1.4 對Arthus反應(yīng)大鼠皮膚組織病理學(xué)的影響 正常組大鼠表皮未見明顯異常，結(jié)構(gòu)完整，部分可見輕度增厚；鱗狀上皮細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常、排列緊密；真皮層膠原纖維含量豐富，可見毛囊皮脂腺等附屬器官，未見明顯炎癥。模型組多見表皮層增厚，少量鱗狀上皮細胞胞質(zhì)空泡化，多數(shù)膠原纖維豐富，排列規(guī)則；部分皮膚局部可見少量上皮細胞壞死及核碎裂，真皮層與皮下組織可見大量水腫，肥大細胞浸潤，出血，并伴有細胞成分增多，靜脈血管可見淤血擴張。各給藥組可見部分表皮增厚，真皮層少量肥大細胞浸潤，個別可見細胞成分增多，實質(zhì)細胞壞死，核碎裂；靜脈血管淤血擴張、出血情況較模型組減輕。結(jié)果見圖3。

3.2 青紫顆粒對兔Arthus反應(yīng)的干預(yù)作用

3.2.1 青紫顆粒對Arthus反應(yīng)兔背部斑點直徑、皮膚反應(yīng)程度的影響 正常組兔背部未出現(xiàn)紅腫現(xiàn)象。抗原攻擊后2 h，各組兔背部均出現(xiàn)紅腫現(xiàn)象；抗原攻擊后2、3、4、5 h，青紫顆粒高劑量組兔背部斑點直徑小于模型組（P＜0.05），結(jié)果見表3。模型組在抗原攻擊后2 h或5 h背部皮膚中度充血、出血，呈斑塊狀；抗原攻擊后24 h，出現(xiàn)中度出血性變色。與模型組相比，青紫顆粒高、低劑量組，蘆丁片組，地塞米松組，青紫合劑組兔背部皮膚反應(yīng)程度評分均顯著降低（P＜0.01），結(jié)果見表3及表4，24 h兔背部斑點見圖4。

表3 青紫顆粒對Arthus反應(yīng)兔背部皮膚斑點直徑的影響(±s) Tab 3 Effect of Qingzi granules on the diameter of the back swollen spots in the Arthus response rabbits at different time points after the antigen attack (±s)

表3 青紫顆粒對Arthus反應(yīng)兔背部皮膚斑點直徑的影響(±s) Tab 3 Effect of Qingzi granules on the diameter of the back swollen spots in the Arthus response rabbits at different time points after the antigen attack (±s)

注：與模型組比較，*P＜0.05。Note：Compared with the model group，*P＜0.05.

組別 n 劑量 不同時間點斑點直徑/mm 2 h 3 h 4 h 5 h 8 h 12 h 24 h正常組 6 - 0 0 0 0 0 0 0模型組 6 - 16.98±5.62 19.98±2.16 20.86±1.37 21.36±2.81 19.77±2.26 20.54±2.10 21.41±4.30地塞米松組 6 0.263 mg·kg-115.18±7.50 19.2±1.94 18.87±2.21 19.75±1.80 19.74±3.77 19.98±2.28 20.21±1.41蘆丁片組 5 5.78 mg·kg-117.17±0.57 17.29±2.18 18.80±1.10 18.39±1.12 19.43±2.25 20.96±3.16 22.69±3.69青紫顆粒高劑量組 6 8.79 g·kg-1 14.11±7.53*16.05±6.19*16.51±6.02*17.13±6.28*18.73±4.39 19.23±5.36 19.17±7.31青紫顆粒中劑量組 4 4.39 g·kg-1 16.65±4.58 18.78±2.40 19.43±0.64 20.07±0.48 20.48±0.74 23.60±5.98 23.4±5.26青紫顆粒低劑量組 5 2.20 g·kg-1 18.52±1.55 18.71±1.36 20.70±1.55 19.05±2.12 20.72±2.88 20.80±6.00 23.22±5.14青紫合劑組 5 6.98 mL·kg-115.58±3.34 19.1±1.16 21.36±2.17 20.19±1.32 19.76±2.99 19.79±2.51 21.14±3.70

表4 青紫顆粒對Arthus反應(yīng)兔背部皮膚反應(yīng)程度的影響(±s) Tab 4 Effect of Qingzi granules on the degree of skin reaction in the Arthus response rabbits (±s)

表4 青紫顆粒對Arthus反應(yīng)兔背部皮膚反應(yīng)程度的影響(±s) Tab 4 Effect of Qingzi granules on the degree of skin reaction in the Arthus response rabbits (±s)

注：與模型組比較，**P＜0.01。Note：Compared with the model group，**P＜0.01.

組別 n 劑量 平均反應(yīng)程度 綜合評分-＋＋＋＋＋＋正常組 6 - 60 0 0 0模型組 6 - 0 0 5 1 2.17±0.41地塞米松組 60.263 mg·kg-10 3 3 0 1.5±0.55**蘆丁片組 55.78 mg·kg-10 4 1 0 1.2±0.45**青紫顆粒高劑量組68.79 g·kg-1 0 4 2 0 1.33±0.52**青紫顆粒中劑量組44.39 g·kg-1 0 1 3 0 1.75±0.5青紫顆粒低劑量組52.20 g·kg-1 0 4 1 0 1.2±0.45**青紫合劑 56.98 mL·kg-10 4 1 0 1.2±0.45**

圖4 青紫顆粒對Arthus反應(yīng)兔背部皮膚斑點的影響Fig 4 Effect of Qingzi granules on the back swollen spots in the Arthus response rabbits

3.2.2 青紫顆粒對Arthus反應(yīng)兔血清IgA、IgG、CIC的影響 與正常組相比，模型組兔血清IgA、IgG、CIC含量顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組相比，地塞米松組兔血清IgA含量降低（P＜0.05），青紫顆粒中劑量組、青紫合劑組兔血清IgG含量顯著降低（P＜0.01），青紫顆粒中、低劑量組，地塞米松組兔血清CIC含量顯降低（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見圖5。

圖5 青紫顆粒對Arthus反應(yīng)兔血清IgA（A）、IgG（B）、CIC（C）水平的影響Fig 5 Effect of Qingzi granules on serum IgA（A），IgG（B），CIC（C）level in the Arthus response rabbits

3.2.3 皮膚組織病理學(xué)觀察 正常組兔皮膚表皮層結(jié)構(gòu)完整，鱗狀上皮細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常、排列緊密，真皮層膠原纖維含量豐富，可見毛囊皮脂腺等附屬器官，未見明顯炎癥。模型組真皮層底部可見重度水腫，結(jié)締組織排列疏松，部分伴有靜脈血管淤血擴張，可見大量淋巴細胞、中性粒細胞與巨噬細胞浸潤，真皮層頂部可見大量出血，伴有較大量的膠原纖維溶解。各給藥組部分可見重度水腫，伴有大量淋巴細胞、中性粒細胞與巨噬細胞浸潤，實質(zhì)細胞壞死，核碎裂及靜脈血管淤血擴張。與模型組相比，各給藥組在血管擴張方面均減輕，青紫合劑組皮膚出血有所減輕，青紫顆粒低劑量組、蘆丁片組、青紫合劑組皮膚水腫有所緩解。結(jié)果見圖6。

圖6 青紫顆粒對Arthus反應(yīng)兔皮膚組織病理的影響（HE染色，×200）Fig 6 Effect of Qingzi granules on skin tissue histopathology in the Arthus response rabbits（HE，×200）A.正常組（normal group）；B.模型組（model group）；C.地塞米松組（dexamethasone group）；D.蘆丁片組（rutin tablet group）；E.高劑量組（high-dose group）；F.中劑量組（middle-dose group）；G.低劑量組（low-dose group）；H.青紫合劑組（Qingzi mixture group）

4 討論

HSP的發(fā)生與免疫反應(yīng)、紅細胞血管外溢、血管壁纖維素樣壞死、血小板微血管炎和間質(zhì)水腫等有關(guān)[6]?？乖M入機體刺激漿細胞，產(chǎn)生抗體，與抗原結(jié)合形成免疫復(fù)合物，主要為IgA免疫復(fù)合物[7]。過多的免疫復(fù)合物不易被巨噬細胞清除，而促進釋放5-羥色胺、組胺等血管活性物質(zhì)，增加血管壁通透性，造成組織水腫。免疫復(fù)合物在血管壁或腎小球膜上沉積，產(chǎn)生過敏毒素，使中性粒細胞在沉積處聚集，并釋放蛋白水解酶，局部組織血管損傷加劇，沉積在黏膜小血管，引起出血[8]。因此HSP的發(fā)病機制為可溶性免疫復(fù)合物引起的Ⅲ型超敏反應(yīng)[6]。本實驗中以皮膚損傷為主的HSP模型是根據(jù)Ⅲ型超敏反應(yīng)中局部免疫復(fù)合物引起的Arthus反應(yīng)構(gòu)建的[9]。實驗性Arthus反應(yīng)可采用具有循環(huán)抗體的免疫動物，以相應(yīng)的抗原肌內(nèi)注射、皮下注射引起[10]。SD大鼠、日本大耳白兔是具有循環(huán)抗體的免疫動物，經(jīng)過小劑量抗原反復(fù)刺激，少量抗原持續(xù)進入體內(nèi)致敏，但未發(fā)生過敏反應(yīng)；當(dāng)再次皮內(nèi)注射抗原攻擊后，局部血管中彌散的大量抗原與血液中的抗體結(jié)合形成免疫復(fù)合物沉積于血管壁，觸發(fā)皮膚炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)與HSP皮膚癥狀相近，為局部皮膚水腫、出血和壞死，通常伴有血栓形成而造成局部組織的缺血、損傷。大鼠發(fā)生Arthus反應(yīng)時，肌內(nèi)注射卵蛋白的次數(shù)比兔多，但Arthus反應(yīng)的皮膚癥狀不如兔劇烈，這可能與大鼠體內(nèi)不易形成沉淀素有關(guān)[2]。本研究建立的Arthus反應(yīng)大鼠、兔模型主要表現(xiàn)為皮膚損傷，可在一定程度上模擬皮膚型HSP。

在HSP的發(fā)病過程中，IgA發(fā)揮重要作用，歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟會議已將活檢示皮膚或腎小球基底膜上IgA類免疫復(fù)合物沉積作為診斷HSP主要標(biāo)準(zhǔn)之一[11]。體液免疫功能紊亂，B淋巴細胞克隆活化，血清中IgA水平增高，使機體清除功能障礙，IgA及IgA免疫復(fù)合物沉積于血管，形成CIC[12]。由于CIC長時間游離于血液和其他體液中，可隨血流沉積在某些部位的毛細血管壁或嵌合在腎小球基底膜上，造成局部組織的損傷和炎癥。劉明月等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在HSP患者血清中循環(huán)的IgA型抗中性粒細胞胞質(zhì)抗體以及IgA型類風(fēng)濕因子表達增多，證實IgA、CIC在HSP發(fā)病中起關(guān)鍵作用。本實驗結(jié)果顯示模型組血清IgA及CIC水平明顯高于正常組，青紫顆粒各劑量均可降低大鼠血清IgA水平，青紫顆粒高、中劑量均可降低大鼠血清CIC水平，青紫顆粒中、低劑量均能降低兔血清CIC水平。提示青紫顆粒對Arthus反應(yīng)過程中血清IgA、CIC含量升高有干預(yù)作用。

IgG是體內(nèi)最主要的抗體，具有抗病毒、抗菌及免疫調(diào)節(jié)的作用，免疫復(fù)合物中存在的IgG可能與系膜細胞上的Fc-γ受體結(jié)合[13]，在促進免疫復(fù)合物沉積方面發(fā)揮作用。臨床研究表明，HSP患者在治療后IgG水平明顯下降至正常，說明隨著T淋巴細胞功能的恢復(fù)，B淋巴細胞的失控和組織炎癥因子的異常分泌得到有效的控制，因此血清IgG也可作為HSP活動期的臨床觀察指標(biāo)[14]。本實驗結(jié)果顯示模型組血清IgG水平高于正常組，青紫顆粒各劑量組均可降低大鼠血清IgG水平，青紫顆粒中劑量組可降低兔血清中IgG含量，表明青紫顆粒對Arthus反應(yīng)過程中血清IgG含量升高有抑制作用。

T淋巴細胞功能的改變、細胞因子與炎癥介質(zhì)的參與在HSP發(fā)病中發(fā)揮重要作用。TNF-α在免疫及炎癥損傷中具有重要地位，能使凝血因子Ⅷ、纖溶酶原激活物抑制劑-1、血栓素、內(nèi)皮素含量上升，最終引起凝血和微循環(huán)障礙，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細胞壞死[15]，并與IgA協(xié)同作用引起血管炎癥[16]。Besbas等[17]報道HSP患者急性期血清促炎細胞因子TNF-α的水平明顯增加。本實驗結(jié)果顯示，模型組大鼠血清TNF-α水平明顯高于正常組，青紫顆粒高劑量可降低TNF-α水平，提示青紫顆粒對Arthus反應(yīng)過程中血清TNF-α含量升高有一定抑制作用。IL-6是一種促炎因子，刺激血管內(nèi)皮細胞，釋放大量的白細胞趨化因子，使白細胞和內(nèi)皮細胞相黏附，導(dǎo)致內(nèi)皮細胞受損，同時生成氧自由基，引發(fā)細胞變性、壞死[18]。此外，IL-6可促進B淋巴細胞增殖及分化，通過刺激B細胞分泌大量抗體，導(dǎo)致體液免疫反應(yīng)的發(fā)生，形成大量免疫復(fù)合物沉積于血管壁，激活補體級聯(lián)反應(yīng)，破壞血管壁的完整性，進一步加重血管損傷程度[19]。臨床研究報道HSP患者急性期血清促炎細胞因子IL-6的含量顯著增加[20]。本實驗結(jié)果顯示，模型組血清IL-6水平明顯高于正常組，青紫顆粒高劑量能降低IL-6含量。

NO是一種胞間信使信號，可介導(dǎo)多種炎癥發(fā)生，主要由iNOS催化產(chǎn)生。NO可介導(dǎo)細胞毒作用，使血管內(nèi)皮細胞受損，進而促使免疫復(fù)合物的沉積，還可以誘導(dǎo)多種炎性細胞因子的產(chǎn)生[21]。NO水平升高加重毛細血管損傷及腎臟進行性損害[22]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，HSP腎炎患者體內(nèi)NO水平顯著升高，檢測NO水平對HSP患者病情判斷、療效及預(yù)后評價具有一定的指導(dǎo)意義[23]。本實驗結(jié)果顯示青紫顆粒各劑量均可明顯降低大鼠血清NO水平。

臨床報道顯示，HSP皮膚組織病理學(xué)特征包括影響淺表小血管的白細胞破壞性血管炎，血管壁被中性粒細胞浸潤，中性粒細胞部分退化并形成核碎片，真皮乳頭水腫，乳頭下血管叢及末梢血管擴張、充血、內(nèi)皮細胞腫脹，管壁周圍組織纖維蛋白樣變性，紅細胞外滲。本研究結(jié)果顯示，Arthus反應(yīng)大鼠、兔皮膚出現(xiàn)表皮層增厚，少量鱗狀上皮細胞胞質(zhì)空泡化，上皮細胞壞死及核碎裂，真皮層與皮下組織可見大量水腫，炎性細胞浸潤，細胞成分增多，靜脈血管淤血擴張等現(xiàn)象，這與HSP皮膚組織病理學(xué)特征相近。青紫顆粒可減輕大鼠皮膚靜脈血管淤血擴張、出血，減輕兔皮膚水腫、實質(zhì)細胞壞死、核碎裂及靜脈血管淤血擴張。

綜上，青紫顆粒在改善HSP動物模型背部皮膚反應(yīng)程度及組織病理學(xué)損傷方面具有較好的藥效，該作用可能與其降低血清IgA、IgG、CIC、IL-6、TNF-α、NO水平，減輕皮膚組織靜脈血管淤血擴張、出血、水腫等有關(guān)，但確切的作用機制有待進一步研究。