夏用恢，李廣利，胡長平（1.中南大學湘雅藥學院藥理學系，長沙 410078；2.株洲市食品藥品檢驗所，湖南 株洲 412011；.湖南工業(yè)大學生命科學與化學學院，湖南 株洲 412007）

多巴胺作為一種重要的兒茶酚類神經(jīng)遞質(zhì)，在中樞神經(jīng)、心血管、腎臟、激素等生理功能調(diào)節(jié)中起著重要的作用[1]。多巴胺水平異常可能引發(fā)帕金森病等多種神經(jīng)精神類疾病，嚴重危害人體健康。因此，發(fā)展低成本、高靈敏度的多巴胺檢測方法對疾病的預防和診斷具有重要意義。目前多巴胺的主要測定方法包括熒光法[2]、色譜法[3-4]、電化學發(fā)光法[1，5]等。這些方法盡管可靠，但往往需要昂貴的儀器設(shè)備、預處理步驟煩瑣耗時。電化學分析法具有成本低、響應(yīng)快速、靈敏度高、設(shè)備簡單便攜等優(yōu)點[6-8]，已廣泛用于多巴胺等生物活性分子的檢測。由于多巴胺常與抗壞血酸和尿酸共存于血清和中樞系統(tǒng)細胞外液中，且三者在裸電極上的氧化峰電位接近，因此多巴胺電化學檢測容易受到干擾[9-10]。金屬納米粒子[11]、碳納米管[12-13]、石墨烯[14-16]等納米材料能顯著提升電極的選擇性，已成為解決干擾問題的主要方法。普魯士藍（Prussian blue，PB）是一種混合價態(tài)的鐵化合物，具有無毒、成本低、電化學性能優(yōu)異等特點，在分子磁體、電致變色器件、電催化、能量轉(zhuǎn)換等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[17]。目前，基于普魯士藍/石墨烯復合材料電化學檢測多巴胺水平的方法尚未見報道。本文擬發(fā)展基于普魯士藍納米花/電化學還原石墨烯復合材料修飾玻碳電極（Prussian blue nanoflower/ electrochemically reduced graphene oxide modified glassy carbon electrode，PB/ ErGO/GCE），以期利用PB與電化學還原石墨烯的協(xié)同增敏作用以提高多巴胺的電化學傳感性能。

1 材料

鐵氰化鉀[K3Fe（CN）6]、亞鐵氰化鉀[K4Fe（CN）6]、無水磷酸二氫鈉、無水磷酸氫二鈉、氯化鉀、鹽酸、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）等試劑均為分析純（國藥化學試劑有限公司）；鹽酸多巴胺（分析純，上海阿拉丁生化股份有限公司）；氧化石墨烯（GO，南京先豐納米材料有限公司）；所有溶液均用超純水（電阻率為18.2 MΩ·cm-1）配制。人血清樣品由株洲市人民醫(yī)院提供。

2 方法

2.1 普魯士藍納米花合成

PB采用低共熔溶劑輔助水熱合成法[18]。具體合成步驟如下：準確稱取0.0320 g K3Fe（CN）6加入100 mL燒杯，在燒杯中分別加入5 mL超純水、5 mL鹽酸和25 mL DMF，磁力攪拌至完全溶解。將上述混合液轉(zhuǎn)移至100 mL聚四氯乙烯內(nèi)純不銹鋼反應(yīng)釜中，80℃下水熱處理24 h。待反應(yīng)結(jié)束后，取出水熱反應(yīng)釜，自然條件下冷卻至室溫，將反應(yīng)溶液以8000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心，得到的產(chǎn)物依次用超純水、無水乙醇、超純水洗滌3次后，置于80℃的烘箱干燥過夜，即可得到花狀結(jié)構(gòu)的PB。將10 mg PB分散于10 mL超純水中，超聲30 min，即可得到1 mg·mL-1的PB分散液。

2.2 PB/GO復合材料制備

將10 mg GO分散于10 mL超純水中，超聲30 min，得到分散均勻的GO分散液（質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1）。將上述制得的PB分散液和GO分散液按體積比1∶10進行混合，超聲分散30 min，即得PB/GO復合材料分散液。

2.3 PB/ErGO復合修飾電極制備

分別使用0.3 μm和0.05 μm Al2O3拋光粉將玻碳電極（GCE）[高仕睿聯(lián)（天津）光電科技有限公司]表面拋光至鏡面，然后將電極分別置于超純水、無水乙醇、超純水中超聲1 min，并置于紅外燈下干燥備用。采用滴涂法制備PB/GO/GCE，再經(jīng)電化學還原法將GO還原即可制得PB/ErGO/GCE。具體制備方法如下：用移液槍移取5 μL PB/GO分散液，滴涂于GCE表面，置于紅外燈下干燥，即得PB/GO/GCE。采用恒電位法還原，將PB/GO/GCE在-1.5 V還原電位還原120 s，即可制得PB/ErGO/GCE。

2.4 電化學測量

所有電化學實驗均在CHI 660E電化學工作站（上海辰華）進行。電化學測試采用標準三電極體系，以裸電極或修飾電極為工作電極，鉑電極為對電極，飽和甘汞電極為參比電極。采用循環(huán)伏安法和電化學阻抗譜表征PB/ErGO/GCE的電化學性能。采用差分脈沖伏安法（differential pulse voltammetry，DPV）定量檢測人血清中多巴胺的含量。

3 結(jié)果與討論

3.1 形貌及微觀結(jié)構(gòu)表征

圖1為PB、GO及PB/GO的掃描電鏡圖譜。PB呈現(xiàn)分散且均勻的花狀結(jié)構(gòu)，直徑在500～800 nm（見圖1A）。GO呈薄層彎曲綿延起伏狀態(tài)，表面具有褶皺結(jié)構(gòu)（見圖1B）。圖1C可以清楚地看到GO絮狀薄層覆蓋包裹PB，表明成功合成了PB/GO。

圖1 PB（A）、GO（B）及PB/GO（C）的掃描電鏡圖譜Fig 1 Scanning electron microscopy images of PB（A），GO（B），and PB/GO composites（C）

圖2為PB、GO及PB/GO的X-射線粉末衍射圖譜。GO在2θ為9.82°處出現(xiàn)明顯的衍射峰，這歸屬于（001）晶面。PB在2θ為17.49°、24.87°、35.50°、39.66°、43.80°、50.79°、54.18°、57.49°處出現(xiàn)明顯的衍射峰，分別對應(yīng)（200）、（220）、（400）、（420）、（422）、（440）、（600）和（620）晶面，與PB標準卡（JCPDS NO.73-0687）吻合。PB/GO的X-射線粉末衍射圖譜中可以清楚地看到GO和PB的特征衍射峰，表明PB/GO復合材料成功合成，PB/GO復合材料中PB的特征衍射峰變?nèi)?，這主要是由于PB與GO的質(zhì)量比為1∶10，大量存在的GO部分掩蓋了PB的特征衍射峰所致。

圖2 PB、GO及PB/GO的X-射線粉末衍射圖譜Fig 2 X-ray powder diffraction patterns of PB，GO，and PB/GO composites

3.2 電化學性能表征

圖3A為GCE、ErGO/GCE、PB/GCE和PBErGO/GCE在5 mmol·L-1K3Fe（CN）6、K4Fe（CN）6和0.1 mol·L-1KCl混合液中的循環(huán)伏安曲線。GCE、ErGO/GCE、PB/GCE和PB/ErGO/GCE的還原峰電流值依次增加，分別為95.34、140.6、146.2、175.2 μA。根據(jù)Randles-Sevcik方程，可計算GCE、PB/GCE、ErGO/GCE和PB/ErGO/GCE的電化學活性面積分別為0.0814、0.125、0.119、0.149 cm2。PB/ErGO/GCE表面活性面積最大，能為多巴胺的電化學氧化提供更多的吸附位點和催化活性位點。此外，還檢測了不同電極在5 mmol·L-1K3Fe（CN）6、K4Fe（CN）6和0.1 mol·L-1KCl混合液中的電化學阻抗譜，見圖3B。從圖中可以看，所有電極的阻抗譜均由半圓和直線組成。高頻區(qū)的半圓部分受電子傳輸控制，其直徑相當于電極表面的電子轉(zhuǎn)移阻抗（Rct）；低頻區(qū)的直線部分受擴散控制。顯然，裸電極的半圓最大，Rct最大。修飾PB或ErGO后，電極的Rct顯著降低。PB/ErGO/GCE的半圓半徑最小，Rct最低，表明PB/ErGO能顯著降低電子在多巴胺與電極表面之間的傳輸阻力，從而提高PB/ErGO的電化學傳感性能。

圖3 不同電極在5 mmol·L-1 K3Fe（CN）6、K4Fe（CN）6（1∶1）和0.1 mol·L-1 KCl混合溶液中的循環(huán)伏安曲線（A）和電化學阻抗譜（B）Fig 3 Cyclic voltammetry（A）and electrochemical impedance spectroscopy（B）of different electrodes in a mixed solution of 5 mmol·L-1 K3Fe（CN）6，K4Fe（CN）6（1∶1）and 0.1 mol·L-1 KCl

3.3 多巴胺在修飾電極上的電化學行為

圖4為1.0 μmol·L-1多巴胺在不同電極上的DPV曲線。多巴胺在裸電極上的陽極峰非常微弱，響應(yīng)峰電流最?。╥pa＝0.398 mA）。在PB/GCE上，多巴胺的陽極峰電流顯著增大，約為裸電極的8倍（ipa＝3.139 mA），這主要是由于PB對多巴胺具有優(yōu)異的催化性能。在ErGO/GCE上，多巴胺的陽極峰電流約為裸電極的12倍（ipa＝4.916 mA），這主要是由于ErGO具有高的比表面積和優(yōu)異的導電性等性能，有效增強了電化學活性面積，降低了電子傳輸阻力。而且ErGO與多巴胺的π-π相互作用進一步增強了多巴胺在電極表面的吸附能力。在PB/ErGO/GCE上，多巴胺的響應(yīng)峰電流高達21.29 mA，約為裸電極的53倍，表明PB和ErGO對多巴胺的氧化具有協(xié)同催化效應(yīng)。

圖4 1.0 μmol·L-1多巴胺在不同電極上的DPV曲線Fig 4 DPV curve for 1.0 μmol·L-1 dopamine recorded at various electrodes

3.4 多巴胺測定條件優(yōu)化

3.4.1 富集條件優(yōu)化 首先檢測了富集時間對多巴胺陽極響應(yīng)峰電流的影響。如圖5A所示，隨著富集時間的不斷延長，多巴胺陽極峰電流逐漸增大；富集時間為240 s時，多巴胺陽極峰電流最大；繼續(xù)延長富集時間，多巴胺陽極峰電流基本不變，表明多巴胺在PB/ErGO/GCE表面吸附達到飽和，故最佳富集時間為240 s。在最佳富集時間240 s下，進一步檢測富集電位對多巴胺陽極峰電流的影響。如圖5B所示，當富集電位從-0.3V正移至0 V，多巴胺陽極峰電流不斷增大；當富集電位進一步正移，多巴胺陽極峰電流反而下降，故最佳富集電位為0 V。

圖5 富集時間（A）和富集電位（B）對1.0 μmol·L-1 多巴胺陽極峰電流的影響Fig 5 Effect of accumulation time（A）and accumulation potential（B）on the anodic peak current of 1.0 μmol·L-1 dopamine

3.4.2 底液pH優(yōu)化 圖6A為多巴胺在底液pH 3.0～8.0的DPV曲線，隨著底液pH不斷增大，多巴胺的陽極峰不斷往負電位方向移動，表明質(zhì)子（H＋）參與多巴胺的電化學氧化過程。當?shù)滓簆H從3.0增加7.0，多巴胺陽極峰電流隨pH增大而增大；當?shù)滓簆H大于7.0，繼續(xù)增大pH，多巴胺陽極峰電流卻降低（見圖6B）。因此，最適底液pH為7.0，接近于生物體液的pH，有利于血清、尿液等生物樣本的檢測。多巴胺陽極峰電位（Epa）與底液pH呈良好的線性關(guān)系（見圖6C），線性回歸方程為Epa（V）＝-0.481pH＋0.535（R2＝0.9972）。該方程的斜率接近于能斯特方程理論值（-0.0592V/pH），表明多巴胺在PB/ErGO/GCE的電化學氧化過程為等電子等質(zhì)子過程。

圖6 不同底液pH下多巴胺在PB/ErGO/GCE的DPV曲線（A）及多巴胺陽極峰電流（B）、峰電位與pH關(guān)系（C）圖Fig 6 DPV curve of dopamine in different pH buffer solution（A）and relationship between pH and anodic peak current（B）or peak potential（C）of dopamine

3.4.3 掃速優(yōu)化 為了探究多巴胺在PB/ErGO/GCE的氧化機制，記錄了不同掃速下多巴胺的循環(huán)伏安曲線。如圖7A，隨著掃速的增加，陽極峰電流（ipa）和陰極峰電流（ipc）均增大。ipa、ipc均與掃速（v）呈良好的線性關(guān)系，表明多巴胺在PB/ErGO/GCE上主要受吸附控制。而且多巴胺的陽極峰電位（Epa）隨著掃速的增加向正電位方向移動，陰極峰電位（Epc）則負移。Epa、Epc均與掃速的自然對數(shù)（lnv）呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程分別為Epa＝0.0228lnv＋0.245（R2＝0.9821）和Epc＝0.0119lnv＋0.098（R2＝0.9883）。對于吸附控制的準可逆過程，結(jié)合Lavrion[19]方程可計算電子轉(zhuǎn)移數(shù)（n）約為2.0。因此，多巴胺在PB/ErGO/GCE的氧化為2電子2質(zhì)子轉(zhuǎn)移過程，其機制如圖8所示。

圖7 多巴胺峰電流（A）及峰電位（B）與掃速的線性關(guān)系圖Fig 7 Linearity between the peak current（A）and peak potential（B）of dopamine and napierian logarithm of scanning rate

圖8 多巴胺在PB/ErGO/GCE上的電化學氧化還原機制Fig 8 Electrochemical redox mechanism of dopamine on PB/ErGO/GCE

3.5 線性范圍和檢出限

在最佳檢測條件下，采用DPV對多巴胺進行定量測定。如圖9A所示，多巴胺濃度為0.5～50 μmol·L-1時，隨著多巴胺濃度的增加，多巴胺陽極峰電流（ipa）隨濃度（C）的增加而不斷增大。而且多巴胺陽極峰電流與濃度的自然對數(shù)呈良好的線性關(guān)系（見圖9B），其線性回歸方程可表示ipa（μA）＝16.30lnC＋22.40（R2＝0.9963）。檢出限為0.06 μmol·L-1。PB/ErGO/GCE的傳感性能與文獻報道[20-24]的修飾電極相當（見表1），表明該電極具有較大的應(yīng)用前景。

圖9 不同濃度多巴胺在PB/ErGO/GCE上的DPV曲線（A）及多巴胺陽極峰電流與濃度自然對數(shù)的線性關(guān)系圖（B）Fig 9 DPV curve of different concentration dopamine at PB/ErGO/GCE（A）and linearity between anodic peak current of dopamine and napierian logarithm of their concentration（B）

表1 PB/ErGO/GCE的傳感性能與文獻報道比較 Tab 1 Sensing performance between the PB/ErGO/GCE and previously reported electrodes

3.6 重復性、再現(xiàn)性和選擇性

為考察電極的重復性，同一電極PB/ErGO/GCE連續(xù)7次測量1 μmol·L-1多巴胺的響應(yīng)峰電流，結(jié)果相對標準偏差（RSD）為5.6%，表明PB/ErGO/GCE具有良好的重復性。為考察電極的再現(xiàn)性，采用相同方法制備的5根PB/ErGO/GCE平行測量1 μmol·L-1多巴胺的響應(yīng)峰電流，其RSD為3.2%，表明該修飾電極具有優(yōu)異的再現(xiàn)性。尿酸、抗壞血酸常與多巴胺共存于血清等生物體液中，且它們的氧化峰電位相近，容易對多巴胺的檢測產(chǎn)生干擾。為考察PB/ErGO/GCE的選擇性，分別測定1 μmol·L-1多巴胺在100倍濃度的尿酸與抗壞血酸共存下的響應(yīng)峰電流，實驗結(jié)果表明，在100倍濃度尿酸與抗壞血酸共存下，相對誤差均低于5.0%，表明PB/ErGO/GCE具有優(yōu)異的選擇性。

3.7 實際樣品檢測

使用PB/ErGO/GCE檢測人血清中的多巴胺濃度以驗證修飾電極的實用性。將4份人血清樣品用0.1 μmol·L-1PBS（pH＝7.0）稀釋10倍，得到待測的人血清樣品。采用DPV定量測定人血清樣品中多巴胺濃度，檢測結(jié)果見表2。1號血清樣品多巴胺濃度為0.64 μmol·L-1。2～4號人血清樣品均未出現(xiàn)多巴胺響應(yīng)峰電流，表明未檢出多巴胺。加標回收試驗中的回收率為95.5%～100.6%，表明PB/ErGO/GCE能精確檢測實際樣品中多巴胺的濃度。

表2 人血清中多巴胺濃度測定(n＝3) Tab 2 Detection of dopamine concentration in human serum samples (n＝3)

4 結(jié)論

本文制備了一種基于PB/ErGO復合納米材料的多巴胺電化學傳感器，成功實現(xiàn)了人血清中多巴胺濃度的檢測。PB/ErGO顯著增大了多巴胺的電化學活性面積，促進了電子在電極表面與多巴胺之間的傳遞。PB/ErGO對多巴胺的電化學氧化表現(xiàn)出明顯的協(xié)同增敏效應(yīng)，極大地提高了多巴胺的電化學響應(yīng)。PB/ErGO/GCE對多巴胺表現(xiàn)出優(yōu)異的傳感性能，動態(tài)響應(yīng)范圍為0.5～50 μmol·L-1，檢出限為0.06 μmol·L-1。PB/ErGO/GCE能準確檢測人血清中多巴胺的含量，回收率為95.5%～100.6%。鑒于其具有低成本，高靈敏度，優(yōu)異的重復性、再現(xiàn)性和穩(wěn)定性等優(yōu)點，PB/ErGO/GCE在生物樣品中多巴胺的痕量檢測上具有實際應(yīng)用前景。