左清平，黃娟娟，張順芝，何鴿飛（長沙市第一醫(yī)院藥劑科，長沙 410005）

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中不僅惡性程度高，且極易轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)，患者5年內(nèi)的生存率極低[1]。目前治療HCC的方法一般為手術(shù)切除、肝移植、肝動脈介入栓塞化療、射頻消融等，以上治療方法在臨床療效欠佳，因此尋找新的治療方法是臨床一直以來的研究熱點[2]。姜黃素（curcumin）為姜黃的重要活性成分之一，具有抗氧化、抗炎、降血脂、抗動脈粥樣硬化、抗腫瘤等多種生物學作用[3]。研究發(fā)現(xiàn)姜黃素在抗腫瘤方面療效顯著，對乳腺癌、胃癌、甲狀腺癌等多種癌癥中的腫瘤細胞的生長均有明顯的抑制作用[4]。姜黃素可抑制腫瘤組織血管新生，動物實驗發(fā)現(xiàn)姜黃素及其衍生物雙去甲氧基姜黃素能抑制肺癌和胰腺癌的生長和轉(zhuǎn)移，減少腫瘤組織微血管數(shù)目[5]。此外，姜黃素具有明顯的抗炎作用，可下調(diào)白細胞介素（IL）-1β、IL-6等炎癥細胞因子的表達，抑制機體的炎癥反應(yīng)，抑制腫瘤的進展[6]。NLR家族是啟動的炎癥體形成的主要感受器蛋白，且擁有眾多的活化信號，其中神經(jīng)中樞內(nèi)Nod樣受體蛋白3（Nod-like receptor protein 3，NLRP3）的活性信號最為廣泛多樣，其可以在眾多病原體或非病原體來源刺激物刺激下活化，參與炎癥相關(guān)疾病的發(fā)展[7]。NLRP3表達上調(diào)能夠通過激活下游多種炎癥信號通路促進、加劇炎性細胞對肝臟組織的浸潤[8]。有研究顯示，IL-1β的上升能夠通過加劇體內(nèi)急性炎性反應(yīng)，對機體的免疫損傷過程產(chǎn)生不同程度的影響[9]。已有多篇文獻報道，IL-1β可能在肝癌進展過程中具有重要的促進作用，由于IL-1β同時也是炎癥體活化的重要產(chǎn)物，因此推測炎性小體功能失調(diào)可能在肝癌的進展中具有重要作用[10]。本研究旨在探究姜黃素對人肝癌裸鼠原位種植瘤生長及NLRP3和IL-1β表達的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞株與培養(yǎng)

HepG2肝癌細胞株（上海中科院細胞庫，批號：ZYK20201015）。將HepG2細胞常規(guī)置于含10%胎牛血清、青霉素、鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，胰蛋白酶對細胞進行消化傳代，每3日換液傳代1次。

1.2 實驗動物

選用湖南斯萊克景達實驗動物有限公司購買的BALB/c-nu型雌性裸鼠53只，SPF級，體質(zhì)量為15～20 g，5周齡。小鼠均統(tǒng)一飼養(yǎng)在SPF級動物房內(nèi)，溫度恒定23～25℃，相對濕度為40%～60%，自由飲水，食用60℃輻射滅菌飼料。

1.3 試藥與儀器

姜黃素（上海阿拉丁試劑有限公司，批號：ST20200211）；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶（GIBCO公司）；熒光定量PCR試劑盒（Ambion公司）；原位細胞凋亡檢測試劑盒（Promag公司）；兔抗人NLRP3、IL-1β單克隆一抗（美國Epitomics公司）。

1.4 人肝癌HepG2細胞皮下種植瘤模型的建立

取對數(shù)生長期的人肝癌HepG2細胞，消化、離心后用PBS溶液洗滌，重懸細胞，調(diào)整為5×106個·mL-1的細胞懸液，將其置于EP管中。取3只裸鼠，其頸部皮下作為接種部位，酒精消毒接種部位，用1 mL注射器吸取100 μL HepG2細胞懸液，分別接種于裸鼠頸部皮下，1周左右出現(xiàn)肉眼可見腫瘤；3周腫瘤生長至0.8 cm×1.0 cm×1.2 cm時處死荷瘤裸鼠，無菌條件下剝離瘤體，放入培養(yǎng)液中剔除結(jié)締組織，將腫瘤組織分割成碎塊（1 mm×1 mm×1 mm）。麻醉50只裸鼠，對手術(shù)部位的皮膚消毒后，沿右肋緣下作1 cm的橫切口，暴露肝右葉；用眼科剪在肝實質(zhì)剪出長、深同約2 mm的切口，將1塊HepG2組織碎塊植入切口內(nèi)，縫合將其固定，當活動無出血后，縫合逐層關(guān)腹。手術(shù)全過程均在超凈工作臺中完成。

1.5 動物分組和給藥

腫瘤移植后的第3日，將50只BALB/c裸鼠隨機分為模型對照組，姜黃素低、中、高劑量組，順鉑組，每組10只。模型對照組給予腹腔注射生理鹽水干預(yù)，每只裸鼠0.2 mL；順鉑組給予腹腔注射2 mg·kg-1順鉑干預(yù)治療；姜黃素低、中、高劑量組分別給予25、50、100 mg·kg-1姜黃素溶液腹腔注射；所有裸鼠均每3日給藥1次，共連續(xù)給藥7次。

1.6 腫瘤抑制率比較

末次給藥3 d后頸椎脫臼處死裸鼠，完全剝離瘤體組織，測量腫瘤最長徑、最短徑，稱量腫瘤，計算腫瘤體積抑制率和腫瘤重量抑制率。

1.7 TUNEL檢測肝癌細胞凋亡指數(shù)

給藥結(jié)束后2 d，頸椎脫臼處死部分裸鼠，完全剝離原位種植瘤，瘤塊以最大面對剖，取其1/2，剖成2～3 mm厚度的薄片，固定于福爾馬林溶液中，石蠟包埋組織，并用切片機切成4 μm的薄片，檢測切片中腫瘤細胞的凋亡指數(shù)；凋亡細胞為棕黃色，藍紫色為陰性細胞。選每張切片組織的10個高倍視野，隨機取2000個腫瘤細胞陽性細胞計數(shù)，計數(shù)時避開腫瘤壞死區(qū)，計算凋亡指數(shù)。

1.8 免疫組化檢測CD31表達并計算微血管密度（MVD）

CD31用來標記血管內(nèi)皮細胞，陽性細胞被染成棕黃色。MVD計數(shù)方法：只要出現(xiàn)血管內(nèi)皮細胞或內(nèi)皮細胞群染成棕色，并且與鄰近微血管、腫瘤細胞或其他結(jié)締組織分開的為一條血管。先在×100視野下選取3個血管高密度的區(qū)域。再在×200鏡計數(shù)每個區(qū)域的血管數(shù)量，作為此腫瘤的微血管密度。

1.9 qRT-PCR檢測NLRP3、IL-1β mRNA表達

取腫瘤組織在冰上研磨，將組織制成勻漿后離心，取上清液并測定總RNA，置于-80℃冰箱中保存。采用cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對RNA樣品進行轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄條件：預(yù)變性93℃，2 min，1個循環(huán)；變性93℃，1 min，退火55℃，1 min，延伸72℃，1 min，40個循環(huán)。用2-△△Ct法計算相對表達量，引物序列見表1。

表1 基因引物序列信息 Tab 1 Gene primer sequence information

1.10 Western blot檢測NLRP3、IL-1β蛋白表達

分別取各組裸鼠腫瘤組織，研磨后將組織裂解，離心組織后收集上清液，提取總蛋白。取5組裸鼠的蛋白樣品轉(zhuǎn)至PVDF膜上，脫脂奶粉封閉蛋白樣品1 h，在樣品中加入一抗，孵育樣品過夜（4℃）。加入二抗后用TBST溶液清洗，凝膠成像并分析。

1.11 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，單因素方差比較分析多組間的數(shù)據(jù)，t檢驗比較兩組間的結(jié)果，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對各組裸鼠腫瘤體積和質(zhì)量的影響

與模型對照組相比，姜黃素低、中、高劑量組裸鼠的腫瘤質(zhì)量和體積均呈梯度減少（P＜0.05）；高劑量組裸鼠腫瘤質(zhì)量和體積較順鉑組相比無明顯的差異（P＞0.05）。

與模型對照組相比，姜黃素低、中、高劑量組裸鼠的瘤重抑制率和瘤體積抑制率均呈梯度增加，且高劑量組裸鼠的瘤重抑制率和瘤體積抑制率最高；姜黃素高劑量組與順鉑組裸鼠瘤重抑制率和瘤體積抑制率無顯著的差異，見表2。

表2 各組裸鼠腫瘤質(zhì)量和體積比較(±s，n＝10) Tab 2 Tumor mass and volume of nude mice in each group (±s，n＝10)

表2 各組裸鼠腫瘤質(zhì)量和體積比較(±s，n＝10) Tab 2 Tumor mass and volume of nude mice in each group (±s，n＝10)

注：與模型對照組相比，aP＜0.05；與姜黃素低劑量組相比，bP＜0.05；與姜黃素中劑量組相比，cP＜0.05。Note：Compared with the model control group，aP＜0.05；compared with the low dose group，bP＜0.05；compared with the middle dose group，cP＜0.05.

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2.2 姜黃素對肝癌細胞凋亡的影響

肝癌細胞的細胞核中央呈圓形，均為棕黃色，細胞形態(tài)無缺失。模型對照組細胞大部分形態(tài)正常，少量細胞核內(nèi)有著色情況；除模型對照組外，其余4組均有腫瘤細胞凋亡，顯微鏡下可見凋亡細胞核內(nèi)呈棕黃色，細胞核呈高度凝聚（見圖1）。與模型對照組相比，姜黃素低、中、高劑量組和順鉑組裸鼠肝癌細胞凋亡指數(shù)均顯著增加（P＜0.05）；凋亡指數(shù)排序為高劑量組＞中劑量組＞低劑量組（P＜0.05），高劑量組裸鼠細胞凋亡指數(shù)和順鉑組相比無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），見表3。

圖1 各組腫瘤細胞凋亡情況（×400）Fig 1 Apoptosis of tumor cells in each group（×400）

表3 各組裸鼠腫瘤細胞凋亡指數(shù)比較(±s，n＝10) Tab 3 Tumor cell apoptosis index in nude mice in each group (±s，n＝10)

表3 各組裸鼠腫瘤細胞凋亡指數(shù)比較(±s，n＝10) Tab 3 Tumor cell apoptosis index in nude mice in each group (±s，n＝10)

注：與模型對照組相比，aP＜0.05；與姜黃素低劑量組相比，bP＜0.05；與姜黃素中劑量組相比，cP＜0.05。Note：Compared with the model control group，aP＜0.05；compared with the low dose group，bP＜0.05；compared with the middle dose group，cP＜0.05.

組別 凋亡指數(shù)/%模型對照組 1.23±0.54姜黃素低劑量組 5.67±1.02a姜黃素中劑量組 8.92±1.46ab姜黃素高劑量組 15.33±2.17abc順鉑組 16.01±2.21abc

2.3 姜黃素對肝癌微血管密度的影響

姜黃素低、中、高劑量組及順鉑組裸鼠腫瘤的微血管數(shù)目較模型組均有不同程度的減少，且呈逐漸遞減趨勢，高劑量組＜中劑量組＜低劑量組（P＜0.05）；高劑量組和順鉑組裸鼠間微血管數(shù)量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖2。

圖2 各組裸鼠微血管數(shù)目比較Fig 2 Number of microvessels in nude mice in each group

2.4 姜黃素對NLRP3、IL-1β mRNA表達的影響

姜黃素低、中、高劑量組及順鉑組裸鼠組織中NLRP3、IL-1βmRNA表達較模型對照組均不同程度的減少（P＜0.05）；低、中劑量組裸鼠腫瘤組織中NLRP3、IL-1βmRNA表達高于高劑量組和順鉑組（P＜0.05）；高劑量組和順鉑組裸鼠腫瘤組織中NLRP3、IL-1βmRNA表達無顯著差異（P＞0.05），見圖3。

圖3 各組裸鼠腫瘤組織中NLRP3（A）、IL-1β（B）mRNA表達情況Fig 3 NLRP3（A）and IL-1β（B）mRNA expression in tumor tissues of nude mice in each group

2.5 姜黃素對NLRP3、IL-1β蛋白表達的影響

與模型對照組相比，中、高劑量組和順鉑組裸鼠腫瘤組織中NLRP3、IL-1β蛋白表達均呈不同程度減少，且呈逐漸遞減趨勢，高劑量組和順鉑組裸鼠腫瘤組織中NLRP3、IL-1β蛋白表達明顯低于低劑量組和中劑量組（P＜0.05）；且高劑量組和順鉑組裸鼠腫瘤組織中NLRP3、IL-1β蛋白表達無顯著差異（P＞0.05），見圖4。

圖4 各組裸鼠腫瘤組織中NLRP3、IL-1β蛋白表達情況Fig 4 Expression of NLRP3 and IL-1β proteins in tumor tissues of nude mice in each group

3 討論

中國是肝癌大國，全球每年一半以上的新發(fā)肝癌病例發(fā)生在中國。在我國所有消化道惡性腫瘤中，肝癌是死亡率最高的腫瘤之一[11]。肝癌診斷后生存期常小于6個月，生存期5年以上者僅為5%～9%。手術(shù)治療是目前根治肝癌的主要方法，對于中晚期的肝癌患者不能進行手術(shù)時，臨床上提倡綜合治療[12]。近年來，許多單味中藥中的提取物已被證實具有顯著的抗腫瘤活性。有學者研究發(fā)現(xiàn)，中藥可通過多靶點、多環(huán)節(jié)及多效應(yīng)抗腫瘤，且療效顯著，不僅對患者的生活質(zhì)量有明顯的改善，還能一定程度地延長患者的生存期[13]。姜黃素來源豐富，廣泛存在于姜科植物姜黃、莪術(shù)、郁金中，在不同的細胞類型中表現(xiàn)出不同的效應(yīng)，誘導(dǎo)效應(yīng)產(chǎn)生的分子機制也不盡相同。目前國內(nèi)外研究普遍認為姜黃素的抗腫瘤作用機制可能主要與抑制腫瘤細胞的生長和增殖、誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡有關(guān)，而且是通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子的活性，調(diào)控癌基因、抑癌基因蛋白和凋亡調(diào)控蛋白的表達等途徑抑制腫瘤細胞的生長和增殖，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡[14]。姜黃素對大腸癌、膀胱癌、前列腺癌及乳腺癌等腫瘤的化學防護作用已得到部分證實[15]。

焦亡又稱細胞炎性壞死，是一種程序性細胞死亡，表現(xiàn)為細胞不斷膨脹增大直至細胞膜破裂，導(dǎo)致細胞內(nèi)容物經(jīng)由焦亡孔釋放進而激活強烈的炎癥反應(yīng)[16]。焦亡與細胞凋亡有著共同的特征，包括DNA斷裂、核濃縮、caspase依賴性和Annexin V染色陽性。然而不同于凋亡，細胞焦亡發(fā)生得更快，并會伴隨著大量促炎癥因子的釋放。細胞發(fā)生焦亡時，細胞會發(fā)生腫脹，在細胞破裂之前，細胞上形成凸出物，之后細胞膜上形成孔隙，使細胞膜失去完整性，釋放內(nèi)容物，引起炎癥反應(yīng)，此時，細胞核位于細胞中央，隨著形態(tài)學的改變，細胞核固縮，DNA斷裂[17]。NLRP3及IL-1β作為焦亡通路的關(guān)鍵蛋白在肝癌細胞的增殖、轉(zhuǎn)移、診斷和預(yù)后中發(fā)揮重要作用[18]。研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3、ASC、Caspase-1和IL-1β在肝癌實質(zhì)細胞中的表達顯著低于癌旁組織，且成正相關(guān)。肝癌發(fā)生時，NLRP3表達明顯下調(diào)，隨著肝癌進展，NLRP3炎癥組分的表達水平與肝癌患者的病理分級和臨床分期成負相關(guān)[19]。另有研究表明，肝癌細胞在缺氧條件下發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致NLRP3、Caspase-1激活，進而促進炎性因子釋放導(dǎo)致肝癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[20]。此外，炎性細胞因子IL-1β可通過促進ST3Gal IV和FUT I基因的表達，從而促進肝癌的轉(zhuǎn)移[21]。因此，基于焦亡相關(guān)基因開發(fā)靶向藥物或篩選治療藥物可能是肝癌治療的新策略。

本研究比較了不同濃度的姜黃素對制備的裸鼠肝移植瘤模型中腫瘤的影響，結(jié)果顯示與模型對照組相比，姜黃素低、中、高劑量組裸鼠的腫瘤質(zhì)量和體積均明顯減小，說明姜黃素對肝癌有抑制作用，姜黃素低、中、高劑量組裸鼠肝癌細胞凋亡指數(shù)高于模型對照組，可見姜黃素對腫瘤細胞凋亡有促進作用，且呈濃度依賴性。曹聰?shù)萚22]研究證實，不同濃度的姜黃素均可抑制肝癌耐藥細胞HepG2/ADM的增殖。在5、10、20、40 μg·mL-1姜黃素作用下HepG2/ADM細胞的增殖抑制率隨著藥物濃度的增加而增加。

肝內(nèi)MVD可作為肝癌患者無病生存率預(yù)測因子。因此對肝癌的血管生成進行有效的抑制也是治療肝癌的重要途徑，抑制血管生成也成為肝癌藥物研發(fā)重要的策略之一[23]。本研究結(jié)果顯示，姜黃素可降低MVD，減少血管生成，抑制肝癌細胞生長，姜黃素濃度越高效果越明顯。NLRP3作為炎性小體，其能影響到體內(nèi)的炎癥信號通路的激活，進而激活下游炎癥因子，促進肝臟間質(zhì)細胞纖維化改變[24]。IL-1β能夠促進肝臟的炎性損傷，同時還能調(diào)控樹突狀T淋巴細胞的功能，影響到免疫細胞的功能活性[25]。不同濃度姜黃素干預(yù)移植瘤裸鼠后腫瘤組織中NLRP3、IL-1β表達均明顯被抑制，且隨姜黃素濃度增加，蛋白抑制效果越顯著，提示姜黃素對肝癌組織中NLRP3、IL-1β表達有明顯抑制作用，抑制炎性反應(yīng)，進而對肝癌進行改善。董德嘉等[26]研究證實，結(jié)論檢測NLRP3、IL-1βmRNA表達水平有助于了解酒精性肝硬化的病變肝組織炎癥活動度、肝損傷程度及纖維化程度，對臨床診斷具有一定的指導(dǎo)意義。

綜上所述，姜黃素可抑制HepG2裸鼠移植瘤的生長，對腫瘤組織中NLRP3、IL-1β表達有顯著抑制作用。