崔 凱 吳連軍 張靖媛

（1赤峰市森林草原保護(hù)發(fā)展中心，內(nèi)蒙古赤峰 024000；2赤峰市林業(yè)科學(xué)研究所，內(nèi)蒙古赤峰 024000）

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）原名為紫苜蓿，又名苜蓿，屬于薔薇屬豆科多年生草本植物。其主要呈栽培或半野生狀態(tài)，分布廣泛，在田邊、路旁、曠野、草原等地均可以生長(zhǎng)，并被廣泛種植。紫花苜蓿主要作為飼料或者牧草之用，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值居牧草之首，有“牧草之王”的美譽(yù)。紫花苜蓿具有較高的應(yīng)用價(jià)值[1]。

研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫是制約植物生長(zhǎng)的主要逆境因子之一。了解鹽脅迫條件下的植物應(yīng)答機(jī)制，篩選更多的耐鹽植物，對(duì)鹽堿地改良具有重要意義[2-4]。通常將鹽土、堿土和各種鹽化、堿化的土壤統(tǒng)稱為鹽堿土、鹽漬土或鹽堿地[5]。全球目前有20%～50%的水澆地受到鹽堿的影響，尤其我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)受鹽堿地影響嚴(yán)重。因此，進(jìn)行適當(dāng)?shù)霓r(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整，積極應(yīng)對(duì)生態(tài)環(huán)境變化，發(fā)展牧草飼料作物，有利于促進(jìn)我國(guó)環(huán)境治理和農(nóng)業(yè)發(fā)展[6]。

茉莉酸甲酯屬于茉莉酸類化合物，是廣泛存在于植物體內(nèi)的一種生物調(diào)節(jié)劑。其在植物應(yīng)答非生物和生物脅迫的反應(yīng)中具有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，是植物受脅迫信號(hào)通路中不可缺少的部分[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)，茉莉酸甲酯可誘導(dǎo)植物防御機(jī)制，以應(yīng)對(duì)病原體、傷口和環(huán)境脅迫[9]。茉莉酸甲酯是一種細(xì)胞調(diào)節(jié)因子，主要參與植物生長(zhǎng)、果實(shí)發(fā)育、種子萌發(fā)等過程。分子學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，與茉莉酸甲酯相關(guān)的基因在不同脅迫條件下的表達(dá)也發(fā)生了變化，并且這種變化有助于提高植物抗性[10]。本研究探討了施加外源茉莉酸甲酯后紫花苜蓿對(duì)鹽脅迫的應(yīng)答機(jī)制，以期為鹽脅迫下茉莉酸甲酯調(diào)控苜蓿幼苗生長(zhǎng)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為紫花苜蓿，由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供，種子發(fā)芽率為98%。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 NaCl脅迫濃度的篩選。選大小一致的紫花苜蓿種子，播于培養(yǎng)皿上進(jìn)行催芽。當(dāng)種子出芽后，挑選出芽一致的種子進(jìn)行水培，水培液體采用Hoagland營(yíng)養(yǎng)液，隔1 d更換1次營(yíng)養(yǎng)液，同時(shí)添加0、50、100、150、200、250、300 mmol/L NaCl進(jìn)行相應(yīng)處理。 6 次重復(fù)，培育環(huán)境條件為25℃，光照培養(yǎng)8 h，黑暗培養(yǎng)16 h；培育7 d后，觀察幼苗生長(zhǎng)情況，并拍照。

1.2.2 NaCl脅迫條件下外源施加茉莉酸甲酯對(duì)紫花苜蓿的影響。將1.2.1篩選出的最佳NaCl脅迫濃度用于此項(xiàng)試驗(yàn)中。試驗(yàn)設(shè)4個(gè)處理，分別為外源施加0.1 mg/mL茉莉酸甲酯處理（A）、外源施加0.1 mg/mL茉莉酸甲酯+200 mmol/L NaCl處理（B）、200 mmol/L NaCl處理（C），以不添加外源物質(zhì)的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液作為對(duì)照（CK）。具體方法為：選大小一致的紫花苜蓿種子，播于培養(yǎng)皿上進(jìn)行催芽；當(dāng)種子出芽后，挑出芽一致的種子進(jìn)行水培，水培液采用Hoagland營(yíng)養(yǎng)液，隔1 d更換1次，同時(shí)添加上述外源物質(zhì)進(jìn)行相應(yīng)處理；每個(gè)處理6次重復(fù)，培育環(huán)境條件為25℃，光照培養(yǎng)8 h，黑暗培養(yǎng)16 h；培育7 d后，觀察植株形態(tài)并拍照，同時(shí)測(cè)定部分生理指標(biāo)。

1.3 測(cè)定指標(biāo)

1.3.1 激素含量的測(cè)定。采用酶聯(lián)吸附免疫法分別測(cè)定葉片和根系內(nèi)的激素含量。具體方法為：將抗激素的單克隆抗體與已固相載體上的Ig抗體結(jié)合，然后加入激素標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品，使其與單克隆抗體結(jié)合，再加入酶標(biāo)激素。通過測(cè)定酶標(biāo)激素的被結(jié)合量，換算未知樣品中激素?cái)?shù)量[11]。

1.3.2 其他各項(xiàng)生理指標(biāo)的測(cè)定。植株長(zhǎng)度和根系長(zhǎng)度經(jīng)過拍照后采用WinRHIZO Pro 5.0a軟件測(cè)定根系長(zhǎng)度；采用稱重法測(cè)定相對(duì)含水量[12]；利用酸性印三酮測(cè)定脯氨酸含量[12]；采用硫代苯巴比妥法測(cè)定丙二醛含量[12]；采用蒽酮法測(cè)定可溶性糖含量[12]；采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定過氧化物酶活性[13]；采用四啖唑藍(lán)法測(cè)定超氧化物歧化酶活性[13]；采用分光光度法測(cè)定過氧化氫酶和抗壞血酸過氧化物酶的活性[13]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行方差分析處理，采用GraphPad Prism 7.03軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaCl脅迫濃度的篩選

篩選紫花苜蓿苗期生長(zhǎng)的最佳NaCl脅迫濃度的基本原則是既可以讓紫花苜蓿植株生長(zhǎng)受到一定程度的抑制又不會(huì)使其死亡。本研究利用7種NaCl濃度梯度對(duì)紫花苜蓿植株進(jìn)行處理，結(jié)果見圖1?？梢钥闯?，隨著NaCl濃度的提高，植株形態(tài)發(fā)生了改變。當(dāng)濃度為250、300 mmol/L時(shí)植株葉片出現(xiàn)萎蔫干枯現(xiàn)象，根系呈現(xiàn)褐色，植株近乎干枯死亡；當(dāng)NaCl濃度為200 mmol/L時(shí)，紫花苜蓿植株萎蔫但是未死亡。因此，本研究選擇200 mmol/L作為NaCl脅迫濃度。

2.2 NaCl脅迫條件下外源施加茉莉酸甲酯對(duì)紫花苜蓿的影響

2.2.1 植株形態(tài)變化情況。從圖2（b）可看出，與CK相比，處理A紫花苜蓿植株高度減少且根系縮短，但分枝明顯，根系相對(duì)粗壯。從圖2（d）可看出，與CK相比，處理C植株分枝減少，且根系分枝也減少，植株整株干枯死亡。綜合來看，在施加外源茉莉酸甲酯后，在一定程度上可緩解由于NaCl脅迫處理后的植株干枯死亡現(xiàn)象，且可在一定程度上促進(jìn)植株生長(zhǎng)。

從表1可以看出：CK植株根系分枝較多，且根系呈白色，同時(shí)植株生長(zhǎng)狀態(tài)正常；處理C植株變得矮小，根系縮短，但分枝較多；處理A根系分枝減少，植株變矮并且萎蔫，根系呈褐色；處理B植株高度、根系長(zhǎng)度與CK相比差異不顯著，只是植株細(xì)弱，但是與處理C相比植株生長(zhǎng)狀態(tài)有所恢復(fù)。

表1 不同處理下紫花苜蓿植株形態(tài)變化情況

2.2.2 相對(duì)含水量、丙二醛、脯氨酸和可溶性糖含量變化情況。從圖3、4可以看出：與CK和處理A相比，處理C葉片和根系的相對(duì)含水量均有所降低；處理B葉片和根系的相對(duì)含水量較處理C有所恢復(fù)。與CK相比，處理A葉片和根系的丙二醛含量并未表現(xiàn)明顯差異，但處理B丙二醛含量顯著升高。與CK相比，處理A葉片中的脯氨酸含量顯著提高，但是根系內(nèi)脯氨酸含量變化不顯著，處理C葉片和根系的脯氨酸含量顯著下降；處理B葉片和根系的脯氨酸含量較處理C均顯著恢復(fù)。與CK相比，處理C葉片和根系內(nèi)的可溶性糖含量下降，處理A、B可溶性糖含量升高，而且兩者之間差異不顯著。

2.2.3 內(nèi)源激素含量變化情況。如圖5所示：與CK相比，處理A、B、C葉片內(nèi)脫落酸、吲哚乙酸的含量均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，處理A葉片內(nèi)玉米素、赤霉素含量增加。如圖6所示：與CK相比，處理A根系內(nèi)玉米素、脫落酸含量增加，吲哚乙酸和赤霉素的含量均降低；處理B、C根系內(nèi)4種內(nèi)源激素的含量均較CK降低。

2.2.4 抗氧化酶活性變化情況。由圖7可知：處理C葉片過氧化物酶活性顯著低于CK以及處理A、B，處理A、B與CK之間差異不顯著；處理A葉片超氧化物歧化酶活性最低，并且顯著低于其他處理，處理B可以顯著提高葉片超氧化物歧化酶活性；處理A葉片過氧化氫酶活性顯著高于CK以及處理B、C，處理C葉片過氧化氫酶活性較CK顯著下降；處理A、B、C葉片抗壞血酸過氧化物酶活性較CK下降，處理A葉片抗壞血酸過氧化物酶活性顯著高于處理B和處理C。

由圖8可知：處理B、C根系過氧化物酶活性低于CK和處理A；處理A、B、C、CK根系超氧化物歧化酶活性和過氧化氫酶活性差異均不顯著；處理C根系抗壞血酸過氧化物酶活性顯著低于CK和處理A、B，且差異顯著。

3 結(jié)論與討論

通常情況下，在鹽脅迫條件下，會(huì)造成植物滲透脅迫或離子毒害、活性氧暴發(fā)，從而導(dǎo)致植物體內(nèi)水分失衡，進(jìn)而破壞膜結(jié)構(gòu)，影響膜功能，使植株生長(zhǎng)受到抑制，終致植株死亡[14]。本研究中選取NaCl作為鹽脅迫條件，觀察紫花苜蓿植株生長(zhǎng)變化特征。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著鹽脅迫濃度的增加，給紫花苜蓿造成了一定的影響。楊躍霞[14]利用NaCl模擬鹽脅迫研究紫花苜蓿應(yīng)答鹽脅迫反應(yīng)機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NaCl適合用于模擬植物鹽脅迫試驗(yàn)。

大量研究表明，一些植物激素可有效緩解鹽脅迫等逆境條件給植株造成的損傷[15]。例如水楊茉莉酸在一定條件下可緩解逆境對(duì)紫花苜蓿的傷害[16]。茉莉酸甲酯廣泛存在于植物體內(nèi)。研究發(fā)現(xiàn)，通過外源施加茉莉酸甲酯可有效激發(fā)防御基因表達(dá)，誘導(dǎo)植株發(fā)生防御反應(yīng)。本文針對(duì)茉莉酸甲酯如何緩解鹽脅迫對(duì)紫花苜蓿幼苗生長(zhǎng)所造成的影響展開研究，同時(shí)測(cè)定了膜系統(tǒng)變化、抗氧化系統(tǒng)和抗氧化物質(zhì)等指標(biāo)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，茉莉酸甲酯可促進(jìn)紫花苜蓿葉片和根系的激素積累，可通過有效調(diào)節(jié)內(nèi)源激素脫落酸、玉米素、赤霉素、吲哚乙酸等調(diào)控紫花苜蓿幼苗生長(zhǎng)。

植物在受到鹽脅迫后，人們可通過植株形態(tài)及生理指標(biāo)的改變來判斷其被逆境影響的程度。其中植物組織相對(duì)含水量可用來表示逆境條件下植物體內(nèi)水分變化情況及所處的生長(zhǎng)狀態(tài)，并可反映植物生存活力[17]。通常來說，在鹽脅迫條件下，會(huì)使植物產(chǎn)生一定的生理傷害，從而造成吸水障礙，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞含水量降低，發(fā)生膜質(zhì)過氧化，相應(yīng)地會(huì)導(dǎo)致丙二醛累積增加、膜系統(tǒng)破壞，增加的膜透性可直接導(dǎo)致電解質(zhì)外滲，從而引起相對(duì)電導(dǎo)率升高[18]。本文發(fā)現(xiàn)：紫花苜蓿在受到NaCl脅迫的條件下，與未添加外源對(duì)照相比，葉片和根系各項(xiàng)指標(biāo)均有一定程度的改變，其中地上組織和地下組織均有大量丙二醛產(chǎn)生，而脯氨酸和可溶性糖含量并不高，但施加外源茉莉酸甲酯后，可有效提高脯氨酸和可溶性糖含量，同時(shí)降低丙二醛含量。這說明外源茉莉酸甲酯可能通過調(diào)節(jié)一些物質(zhì)的產(chǎn)生來抵御NaCl脅迫，使其具有了一定的耐受性。在NaCl脅迫過程中，丙二醛含量出現(xiàn)升高現(xiàn)象，而植株可通過提高可溶性糖和脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而起到一定的保護(hù)作用[19]。與此同時(shí)，不同處理植株含水量及電導(dǎo)率均發(fā)生改變，說明該試驗(yàn)的不同處理對(duì)植株均造成了影響，篩選的處理?xiàng)l件較適宜。茉莉酸甲酯可顯著誘導(dǎo)紫花苜蓿體內(nèi)抗氧化酶及抗氧化物質(zhì)的改變。在NaCl脅迫下，施加茉莉酸甲酯后紫花苜蓿葉片的超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶、抗壞血酸過氧化物酶活性與單獨(dú)施用NaCl處理的植株相比有所提高。在正常情況下，植物細(xì)胞中的自由基會(huì)保持平衡狀態(tài)，即產(chǎn)生自由基的部分和被清除的部分處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。當(dāng)植株遭遇逆境時(shí)，這種平衡會(huì)被打破，導(dǎo)致自由基平衡被打破，并造成大量累積，從而影響植株正常生長(zhǎng)。此時(shí)，抗氧化酶系統(tǒng)中的超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶等將發(fā)揮重要的保護(hù)植物體免受活性氧自由基傷害的作用[20]。茉莉酸甲酯在一定程度上可通過調(diào)節(jié)抗氧化系統(tǒng)來改變NaCl脅迫對(duì)紫花苜蓿造成的傷害。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：與不施用外源物質(zhì)對(duì)照處理相比，單獨(dú)施用茉莉酸甲酯處理的植株葉片和根系的酶活性以及抗氧化物質(zhì)均有所變化。在低溫、高溫等逆境條件下，茉莉酸甲酯可以導(dǎo)致體內(nèi)保護(hù)酶活性升高[21-22]。紫花苜蓿體內(nèi)保護(hù)酶系統(tǒng)在受到外來逆境刺激時(shí)會(huì)發(fā)生變化，急需進(jìn)行有效的機(jī)制調(diào)節(jié)，以保護(hù)自身機(jī)體免受傷害。

綜上所述，使用外源茉莉酸甲酯可有效誘導(dǎo)一系列抗逆系統(tǒng)變化，增強(qiáng)植物抗性。茉莉酸甲酯在調(diào)節(jié)植物生物脅迫和非生物脅迫逆境條件下的反應(yīng)有相似之處，但其誘導(dǎo)植物抗逆的作用機(jī)理還有不明確的部分，尤其是有關(guān)分子水平的研究還有待深入。