楊陽陽，劉志恬，李永才*，畢 陽，盧玉慧，謝鵬東

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

早酥梨是中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所將蘋果與梨進行雜交得到的一種新的梨品種，該品種皮薄肉多、果肉白細、酥脆爽口、汁多味甜，可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)達12.1%～15.1%，可食用率高達95%。除此以外，該品種連續(xù)結(jié)果能力強，豐產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)，所以成為眾多梨品種當(dāng)中的最佳栽培對象之一。早酥梨的采收期為每年的7ü8月，氣溫較高，這對后續(xù)早酥梨的銷售非常不利。微生物侵染會嚴(yán)重影響早酥梨的品質(zhì)，商業(yè)價值迅速降低，給果農(nóng)造成經(jīng)濟損失。其中由互隔交鏈孢（）引起的黑斑病是早酥梨采后主要的病害之一，在室溫環(huán)境下會快速生長繁殖產(chǎn)生毒素，不僅會使果實腐敗，還會對人類和動物健康造成潛在安全風(fēng)險。目前常用人工合成化學(xué)殺菌劑控制梨果采后病害，但因長期使用化學(xué)殺菌劑會產(chǎn)生農(nóng)用殘留、造成環(huán)境污染，也會使病原物產(chǎn)生抗藥性。因此，尋求和開發(fā)對全球環(huán)境以及人類健康無危害的天然殺菌防腐劑來抑制采后病害成為大勢所趨。

枯草芽孢桿菌（）是一種有益的生防細菌，具有較強的生防作用，其作用機制包括競爭作用和拮抗作用。競爭作用主要是對空間以及營養(yǎng)物質(zhì)的爭奪，拮抗作用是指微生物自身在正常的生命活動過程中產(chǎn)生的部分代謝產(chǎn)物會作用于致病菌的細胞器，影響致病菌正常生命活動，導(dǎo)致致病菌不能正常生長繁殖。枯草芽孢桿菌屬的部分代謝物已被證明具有抗真菌活性，在各種芽孢桿菌中，枯草芽孢桿菌已被徹底開發(fā)作為許多植物疾病的生物防治劑。胡陳云等研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌ge25分泌的抑菌脂肽嚴(yán)重影響人參黑斑菌和人參銹腐菌菌絲體的正常生長，導(dǎo)致菌絲體形態(tài)異常、發(fā)育畸形。Ren Jianjun等研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌代謝產(chǎn)物XB-1對桃褐腐病菌有明顯的抑制作用。吡啶-2,6-二羧酸（pyridine-2,6-dipicolinic acid，DPA）是從枯草芽孢桿菌168的分泌物中分離出的一種新的抗真菌化合物，其作為細菌芽孢特有的化合物而成為生物標(biāo)志物，廣泛存在于芽孢中，占芽孢干質(zhì)量的5%～15%。吡啶二羧酸有5種結(jié)構(gòu)不同代謝產(chǎn)物，其中，吡啶-2,3-二羧酸和DPA是芽孢桿菌分泌物中的常見代謝產(chǎn)物，課題組前期預(yù)實驗結(jié)果表明DPA的抑菌效果最佳。從結(jié)構(gòu)上看，吡啶二羧酸屬于吡啶類雜環(huán)化合物。這種化合物具有高效、毒性低等優(yōu)異的生物活性，從而成為綠色抑菌劑研制的新方向。另外，在生產(chǎn)生活中這類化合物應(yīng)用廣泛，農(nóng)業(yè)上可用于殺菌、除草、殺蟲；用于醫(yī)藥上，具有抗癌、消炎、降低血糖等優(yōu)點。Song Xuege等研究發(fā)現(xiàn)5 mmol/L的DPA在pH 5.6時，通過抑制幾丁質(zhì)的合成而顯著抑制生長，在預(yù)防性應(yīng)用中，DPA可將梨樹的潰瘍病發(fā)病率減少90%。目前吡啶二羧酸的相關(guān)研究較少，且DPA在果蔬采后病害控制中的應(yīng)用鮮有報道。因此本實驗使用DPA來處理黑斑病菌，研究DPA對生長的抑制作用，并進一步深入探討其可能的抑菌機理，同時還用DPA對早酥梨果實進行處理，探究DPA對黑斑病的控制作用，以期拓寬DPA適用范圍，為DPA投入市場實際生產(chǎn)應(yīng)用提供理論依據(jù)，同時為控制早酥梨采后病害提供一種新的天然防腐殺菌劑。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

供試菌株為課題組前期研究分離得到，現(xiàn)保藏于本實驗室。

早酥梨采摘于甘肅省景泰縣條山農(nóng)場，挑選大小相近（質(zhì)量約200～250 g）、無機械損傷、無病蟲害的果實，采摘當(dāng)天運至實驗室，靜置24 h散去田間熱后，于冷庫（（3f2）℃、相對濕度85%）中貯藏待用。

DPA購于上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1510型酶標(biāo)儀 美國賽默飛世爾儀器有限公司；H-1850R型臺式高速冷凍離心機 長沙湘儀離心機有限公司；DDS-370微型電導(dǎo)儀 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；BX51型熒光顯微鏡 日本Olympus公司；CentriVap真空離心濃縮儀 美國Labconco公司；ACQUITY Arc四元梯度超快速液相色譜儀 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1孢子懸浮液的配制

參照文獻[17]的方法并略作修改，在超凈工作臺中向培養(yǎng)5 d的培養(yǎng)皿中倒入少量含有體積分?jǐn)?shù)0.01% Tween-80的無菌水，用已滅菌的涂布器輕刮菌絲，將所得溶液通過4 層無菌紗布過濾到三角瓶中，并配制成1h10個/mL孢子懸浮液待用。

1.3.2菌絲的收集

取1 mL 1.3.1節(jié)孢子懸浮液（濃度為1h10個/mL）接種至100 mL馬鈴薯葡萄糖肉湯（potato dextrose broth，PDB）液體培養(yǎng)基中，在28 ℃、150 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)36 h后，用布氏漏斗過濾收集菌絲備用，菌絲用無菌水洗滌3 次，以除去培養(yǎng)液。

1.3.3 DPA處理及相關(guān)指標(biāo)的測定

1.3.3.1 DPA處理及菌落生長評價

參照文獻[18]的方法并稍作修改。分別稱取8.3、16.7、33.4、66.8 mg DPA并溶解于100 mL融化的馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基中，得到含0.5、1.0、2.0、4.0 mmol/L DPA的PDA培養(yǎng)基，以未添加DPA的PDA培養(yǎng)基作為對照組，待培養(yǎng)基凝固后，在培養(yǎng)基中心分別接種2 μL 1.3.1節(jié)孢子懸浮液（濃度為1h10個/mL），28 ℃避光培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)3、5、7、9 d時觀察菌落形態(tài)并采用十字交叉法測量菌落直徑。

1.3.3.2孢子萌發(fā)率和芽管長度的測定

參考文獻[19]的方法并稍作修改。取1 mL 1.3.1節(jié)孢子懸浮液（濃度為1h10個/mL），8 000 r/min離心2 min，棄去上清液，向沉淀中分別加入1 mL不同濃度（0（對照組）、0.5、1.0、2.0、4.0 mmol/L）的DPA溶液，振蕩搖勻。將PDA培養(yǎng)基裁成圓形（＝0.5 mm）放置于滅過菌的載玻片上，培養(yǎng)基中央滴加20 μL上述含有不同濃度DPA的孢子懸浮液，分別于28 ℃孵育2、4、6、8 h后，在光學(xué)顯微鏡下觀察孢子萌發(fā)情況，同時通過IS Capture軟件測量芽管長度。每次觀察，孢子總數(shù)為100個，重復(fù)3 次。按式（1）計算孢子萌發(fā)率。

1.3.4 DPA處理早酥梨及病斑直徑的測定

參照文獻[20]的方法并稍作修改。將挑選好的早酥梨果實用2%（體積分?jǐn)?shù)）的NaClO溶液浸泡2 min，然后用蒸餾水沖洗除去果實表面NaClO溶液，果實晾干后用75%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇溶液擦拭果實表皮。隨后用鐵釘在果實赤道部位均勻地打3個孔，每孔接種20 μL 1.3.1節(jié)孢子懸浮液（濃度為1h10個/mL），室溫晾干后分別向每個孔中加入20 μL濃度為0（即對照組）、5.0、10.0、20.0 mmol/L的DPA溶液，每組9個果實，各組處理好的果實放入分別放入紙箱（60 cmh60 cmh90 cm）中，在每個紙箱中放入一張濕潤的濾紙，以提供果實發(fā)病所需的濕度，于室溫條件下避光貯藏。在貯藏3、5、7、9、11 d觀察果實病斑并采用十字交叉法測量果實的病斑直徑。

1.3.5細胞膜完整性的測定

測定方法參考文獻[21]并稍作修改。將1 mL 1.3.1節(jié)孢子懸浮液（濃度為1h10個/mL）置于2 mL無菌離心管中，8 000 r/min離心2 min，棄去上清液，在沉淀中加入1 mL濃度分別為0（即對照組）、0.5、1.0、2.0、4.0 mmol/L的DPA溶液，在28 ℃培養(yǎng)箱溫育2 h，8 000 r/min離心2 min，棄去上清液，孢子沉淀中加入1 mL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（0.01 mol/L、pH 7.0，后同），室溫下避光靜置30 min，然后8 000 r/min離心2 min，棄去上清液，向孢子沉淀中加入1 mL PBS和10 μL碘化丙啶染液（propidium iodide，PI）（1 mg/mL），避光靜置20 min，然后8 000 r/min離心2 min，棄去上清液。最后加入1 mL PBS洗滌（8 000 r/min離心2 min），洗滌3 次后在熒光顯微鏡下觀察細胞膜完整性并按式（2）計算PI染色率。

1.3.6細胞膜通透性的測定

1.3.6.1菌絲電導(dǎo)率的測定

參考文獻[22]的方法并進行一定的修改。分別測定濃度為0（即對照組）、0.5、1.0、2.0 mmol/L DPA溶液的電導(dǎo)率；稱取1 g 1.3.2節(jié)所得的菌絲，分別添加至10 mL上述濃度的DPA溶液中，室溫下靜置，測定處理0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h時相應(yīng)的電導(dǎo)率。按式（3）計算菌絲電導(dǎo)率。

1.3.6.2核酸滲漏量的測定

參考文獻[23]的方法并進行一定的修改。分別測定濃度為0（即對照組）、0.5、1.0、2.0、4.0 mmol/L DPA溶液在260 nm波長處的吸光度；稱取1 g 1.3.2節(jié)所得的菌絲，分別加入到2 mL上述不同濃度的DPA溶液中，分別在室溫下放置0、1、2、3、4 h取樣，8 000 r/min離心5 min后收集上清液，測定260 nm波長處吸光度。按式（4）計算核酸滲漏量。

1.3.6.3蛋白質(zhì)滲漏量測定

參考文獻[24]的方法并進行一定的修改。分別測定濃度為0（即對照組）、0.5、1.0、2.0、4.0 mmol/L DPA溶液在280 nm波長處的吸光度；稱取1 g 1.3.2節(jié)所得的菌絲，分別加入到2 mL上述不同濃度的DPA溶液中，分別在室溫下放置0、1、2、3、4 h后取樣，8 000 r/min離心5 min收集上清液，在280 nm波長處測定吸光度。按式（5）計算蛋白質(zhì)滲漏量。

1.3.7細胞膜麥角甾醇質(zhì)量濃度的測定

參照文獻[25]的方法并稍作修改。菌絲的培養(yǎng)：分別配制含不同濃度（0（即對照組）、1.0、2.0 mmol/L）DPA的PDA培養(yǎng)基各100 mL，在培養(yǎng)基的中央分別接種2 μL 1.3.1節(jié)孢子懸浮液（濃度為1h10個/mL），28 ℃避光培養(yǎng)；培養(yǎng)至第5天，用已滅菌的取樣勺輕輕刮取PDA培養(yǎng)基上的菌絲（盡量不要刮到培養(yǎng)基），將菌絲置于研缽中，加液氮研磨得到菌粉。麥角甾醇的提?。悍Q取0.1 g研磨后的菌粉，加入3 mL 25%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）氫氧化鉀-醇溶液（甲醇與乙醇體積比為3∶2），渦旋振蕩1 min，然后85 ℃水浴1 h；室溫冷卻后加入1 mL無菌水和3 mL正戊烷渦旋振蕩3 min，室溫靜置10 min，待其分層后吸取上清液，在真空離心濃縮儀中干燥，將干燥后的產(chǎn)物溶于1 mL甲醇（色譜純）中，用0.45 μm孔徑的濾膜過濾后置于1.5 mL進樣瓶中，－20 ℃保存。采用高效液相色譜法測定麥角甾醇質(zhì)量濃度，色譜柱為C柱（250 mmh4.6 mm，5 μm）；流動相為100%甲醇（色譜純）；柱溫為30 ℃；進樣量為5 μL；流速為1 mL/min；紫外檢測器檢測；檢測波長為282 nm。

1.3.8 丙二醛濃度的測定

參考文獻[26]的方法并進行一定修改。稱取0.1 g 1.3.2節(jié)制得菌絲于2 mL試管中，分別加入1.5 mL濃度為0（即對照組）、1.0、2.0 mmol/L的DPA溶液，分別在室溫下處理2、4 h后，8 000 r/min離心5 min。取1 mL上清液，再加入1 mL硫代巴比妥酸試劑，沸水浴15 min，待冷卻至室溫后8 000 r/min離心5 min，分別測定上清液在450、532、600 nm波長處的吸光度、、。按式（6）計算丙二醛濃度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2016軟件處理，實驗設(shè)置3個平行，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用OriginPro 8.5軟件作圖，采用SPSS 26.0軟件進行單因素方差分析。采用Duncan’s事后檢驗進行顯著性分析，＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 DPA處理對A.alternata生長的影響

2.1.1 DPA處理對菌落生長的影響

如圖1所示，DPA處理能顯著抑制菌落的生長（＜0.05），且抑制效果隨處理濃度的增加而增強。同時DPA處理使菌絲的顏色變淺（圖1A）。2.0 mmol/L的DPA處理9 d后菌落直徑僅為對照組的51.76%，當(dāng)DPA濃度為4.0 mmol/L時，菌落生長完全受到抑制（圖1B）。

圖1 DPA處理對A.alternata菌落形態(tài)（A）和菌落直徑（B）的影響Fig.1 Effect of DPA treatment on mycelium morphology (A) and colony diameter (B) of A.alternata

2.1.2 DPA處理對孢子萌發(fā)、芽管伸長的影響

DPA處理能有效抑制的孢子萌發(fā)和芽管伸長（圖2），且其抑制效果隨處理濃度的增加而增強。培養(yǎng)6 h，對照組孢子萌發(fā)率達90%，芽管長度已達494.278 μm。而4.0 mmol/L DPA處理6 h后僅有27.67%的孢子萌發(fā)，芽管長度僅為121.657 μm。

圖2 DPA處理對A.alternata孢子萌發(fā)率（A）和芽管長度（B）的影響Fig.2 Effect of DPA treatment on spore germination rate (A) and germ tube elongation (B) of A.alternata

2.2 DPA處理對早酥梨黑斑病的控制效果

DPA處理對早酥梨黑斑的擴展有抑制作用，且處理濃度越大抑制效果越佳（圖3A）。但與在PDA平板上所用濃度不同，體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)20.0 mmol/L DPA處理才能有效地控制早酥梨的黑斑病。處理前期（第3、5天），5.0 mmol/L DPA處理組與對照組病斑直徑差異不顯著。貯存至第11天時，對照組早酥梨病斑直徑為4.06 cm，而20.0 mmol/L DPA處理組早酥梨病斑直徑（2.24 cm）僅為對照組的55.17%（圖3B）。

圖3 DPA處理對早酥梨病斑外觀（A）和病斑直徑（B）的影響Fig.3 Effect of DPA treatment on the development of black spot disease (A) and lesion diameter (B) on Zaosu pear fruit

2.3 DPA處理對A.alternata細胞膜完整性的影響

為了進一步探索DPA潛在的抗真菌機理，用PI染液檢測細胞膜完整性，PI是一種膜不可滲透的熒光染料，在熒光顯微鏡下，PI染料將失去膜完整性的細胞染為紅色。對照組中僅有個別孢子細胞膜被破壞，發(fā)出微弱紅光，而DPA處理組孢子隨DPA濃度的增大紅光逐漸增強（圖4A）。4.0 mmol/L DPA處理組孢子PI染色率是對照組的8.78 倍（圖4B）。

圖4 DPA處理后PI染色檢測A.alternata細胞膜完整性（A）和PI染色率（B）Fig.4 Cell membrane integrity (A) and propidium iodide (PI) staining percentage (B) of A.alternata after DPA treatment

2.4 DPA處理對A.alternata細胞膜透性的影響

2.4.1 對菌絲電導(dǎo)率的影響

如圖5所示，電導(dǎo)率代表溶液中離子強度的大小，所以電導(dǎo)率的改變可以在一定程度上反映細胞膜透性的改變。DPA處理組菌絲電導(dǎo)率顯著高于對照組（＜0.05），且DPA處理濃度越大，菌絲電導(dǎo)率越大。在處理0.5 h內(nèi)各處理組菌絲電導(dǎo)率均迅速上升，隨后變化趨于平穩(wěn)。處理3 h后，2.0 mmol/L DPA處理組菌絲體電導(dǎo)率為對照組的6.84 倍。

圖5 DPA處理對A.alternata菌絲電導(dǎo)率的影響Fig.5 Effect of DPA treatment on membrane conductivity of A.alternata mycelia

2.4.2 對核酸滲漏量的影響

如圖6所示，DPA處理組菌絲核酸滲漏量顯著高于對照組（＜0.05），且隨著處理濃度增加以及處理時間的延長而增大。處理前1 h內(nèi)，各處理組核酸滲漏量均迅速升高且差異顯著，4.0 mmol/L DPA處理組菌絲核酸滲漏量為對照組的6.23 倍。1 h后各處理組核酸滲漏量緩慢上升，處理4 h時，4.0 mmol/L DPA處理組菌絲的核酸滲漏量為對照組的2.67 倍。

圖6 DPA處理對A.alternata核酸滲漏量的影響Fig.6 Effect of DPA treatment on nucleic acid leakage from A.alternata

2.4.3 對蛋白質(zhì)滲漏量的影響

如圖7所示，DPA處理組菌絲蛋白質(zhì)滲漏量顯著高于對照組（＜0.05），且DPA處理濃度越大蛋白質(zhì)滲漏量越大。處理前1 h內(nèi)，各處理組蛋白質(zhì)滲漏量均迅速升高且差異顯著，4.0 mmol/L DPA處理菌絲蛋白質(zhì)滲漏量為對照組的32.06 倍。1 h后各處理組變化趨于平穩(wěn)，處理4 h時，4.0 mmol/L DPA處理菌絲蛋白質(zhì)滲漏量為對照組的8.99 倍。

圖7 DPA處理對A.alternata蛋白質(zhì)滲漏量的影響Fig.7 Effect of DPA treatment on protein leakage from A.alternata

2.5 DPA處理對A.alternata細胞膜麥角甾醇質(zhì)量濃度的影響

在真菌細胞膜中，麥角甾醇是必不可少的一種成分，其不僅確保了細胞膜結(jié)構(gòu)完整性，而且在營養(yǎng)物質(zhì)運輸、保證細胞膜正常流動以及確保完成細胞內(nèi)正常生理代謝活動等方面均有重要作用。一旦麥角甾醇不能正常合成，細胞膜結(jié)構(gòu)和功能都會受到一定影響，從而會直接導(dǎo)致菌體死亡。如圖8所示，隨DPA處理濃度增加，菌絲的細胞膜麥角甾醇質(zhì)量濃度顯著降低。對照組菌絲細胞膜麥角甾醇質(zhì)量濃度為39.90 μg/mL，而1.0、2.0 mmol/L的DPA處理組菌絲細胞膜麥角甾醇質(zhì)量濃度顯著降低（＜0.05），分別為32.56、19.51 μg/mL。

圖8 DPA處理對A.alternata細胞膜麥角甾醇質(zhì)量濃度的影響Fig.8 Effect of DPA treatment on ergosterol content in A.alternata cell membrane

2.6 DPA處理對A.alternata丙二醛濃度的影響

丙二醛濃度是反映膜脂過氧化程度的指標(biāo)之一。DPA處理可以使丙二醛濃度增加（圖9），并且隨處理濃度增加以及處理時間的延長而增加。處理4 h時，2.0 mmol/L DPA處理組丙二醛濃度為對照組的1.32 倍。

圖9 DPA處理對A.alternata丙二醛濃度的影響Fig.9 Effect of DPA treatment on malondialdehyde content in A.alternata

3 討 論

生防菌枯草芽孢桿菌的許多代謝產(chǎn)物已被證實具有抗真菌活性。Wang Nana等在枯草芽孢桿菌E1R-J發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)代謝產(chǎn)物EP-2。EP-2作為一種抗真菌肽，在100 ℃高溫30 min、pH 1.0～8.0范圍內(nèi)，或在金屬離子（如Cu、Zn、Mg）存在條件下表現(xiàn)出穩(wěn)定的抗真菌活性，同時還發(fā)現(xiàn)EP-2可通過引起菌絲腫脹、扭曲、異常及原生質(zhì)體外滲來抑制的生長，從而有效控制蘋果的腐爛病。劉剛等在枯草芽孢桿菌Loq18的代謝產(chǎn)物中純化出一種新型抗菌蛋白，該抗菌蛋白會使灰葡萄孢菌絲斷裂或畸形，同時抑制孢子萌發(fā)。體內(nèi)實驗表明當(dāng)對照組果實腐爛率達到100%時，經(jīng)抗菌蛋白處理組草莓和葡萄果實的腐爛率分別為60.33%和45.33%。劉雙等將草莓根腐病菌C16-4用枯草芽孢桿菌T4-4、S-30和S-11菌株和代謝產(chǎn)物進行相應(yīng)處理，結(jié)果表明處理組病菌分生孢子的產(chǎn)生與萌發(fā)受到了抑制。另外，通過掃描電子顯微鏡還觀察到處理組菌絲細胞壁表面粗糙，出現(xiàn)細胞膨大、扭曲等畸形現(xiàn)象。DPA是枯草芽孢桿菌菌株中168的分泌物，為探究DPA抑菌效果及機理，Song Xuege等通過掃描電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，在沒有DPA的情況下，細胞呈圓形形態(tài)；而當(dāng)經(jīng)5 mmol/L DPA處理24 h后，細胞膜上產(chǎn)生孔，說明DPA通過破壞真菌細胞膜從而導(dǎo)致細胞凋亡。另外，實驗研究發(fā)現(xiàn)3.0 mmol/L DPA處理減少了分生孢子的數(shù)量，但仍有部分孢子萌發(fā)，而5.0 mmol/L的DPA在pH 5.6的環(huán)境下時，可完全抑制的菌落生長和孢子萌發(fā)。同樣本實驗發(fā)現(xiàn)4.0 mmol/L DPA處理完全抑制了的菌落生長，且抑制了孢子萌發(fā)和芽管伸長，表明不同病原真菌對DPA的敏感性存在差異，但體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)20.0 mmol/L DPA處理才能有效地控制早酥梨的黑斑病，這可能是果實表皮組織對藥物作用的影響，因此需進一步優(yōu)化和規(guī)范DPA的采后處理方法，提高藥物的作用效果。

為進一步探討DPA對的抑菌機制，本實驗用PI染液測定了細胞膜的完整性，PI染液可以通過受損的細胞膜進入細胞內(nèi)部，與胞內(nèi)核酸等物質(zhì)結(jié)合，使其發(fā)出紅光。PI染色結(jié)果表明DPA處理組PI染色率遠高于對照組，說明DPA破壞了細胞膜的完整性。一些吡啶類環(huán)狀化合物也有類似破壞細胞膜的抑菌機理，如氟啶酰菌胺能夠與病原菌的細胞膜和細胞骨架間特異性蛋白結(jié)合，導(dǎo)致細胞結(jié)構(gòu)被破壞，進而表現(xiàn)出殺菌活性。同時DPA處理組菌絲電導(dǎo)率、核酸和蛋白質(zhì)的外滲量均顯著增加，表明DPA處理提高了細胞膜的通透性，造成細胞膜跨膜電勢紊亂，導(dǎo)致離子外流，致使電導(dǎo)率提高。這與枯草芽孢桿菌21代謝物引起大豆茄鐮孢菌菌液電導(dǎo)率升高，顯示出膜透性改變這一相似結(jié)果。同時胞內(nèi)一些物質(zhì)如核酸、蛋白質(zhì)等也因細胞膜通透性增加而外流，使一定波長處的吸光度增大。麥角甾醇是真菌細胞膜重要組成部分，其能保證細胞膜流動性、細胞活力以及營養(yǎng)物質(zhì)的正常運輸，結(jié)果表明，DPA處理導(dǎo)致細胞膜麥角甾醇質(zhì)量濃度顯著降低，這也是其導(dǎo)致細胞膜通透性增加的原因。DPA抑制細胞膜上麥角甾醇合成可能是因其具有雜環(huán)結(jié)構(gòu)。趙圣印等研究發(fā)現(xiàn)雜環(huán)上的氮原子可通過形成配位鍵與甾醇14-脫甲基酶P450的血紅素-鐵活性中心連接，酶的活性受到抑制。而該酶又正是合成麥角甾醇的關(guān)鍵酶，當(dāng)它活性受到抑制后，麥角甾醇將不能正常地合成，病原菌細胞膜完整性遭到破壞，不能進行正常生命活動，從而導(dǎo)致病原菌死亡。同時本研究還發(fā)現(xiàn)DPA處理可促使膜脂發(fā)生過氧化，丙二醛濃度增加，引起細胞膜氧化損傷，從而抑制了病原菌的生長。另外Song Xuege等研究還發(fā)現(xiàn)3.0 mmol/L的DPA處理3 d后會抑制細胞壁中幾丁質(zhì)的合成，表明DPA對真菌細胞壁也具有一定的影響，可見DPA的抑菌機理具有復(fù)雜性和多樣性，具體作用機理有待進一步揭示。

綜上，DPA處理可以有效抑制的菌落生長、孢子萌發(fā)和芽管伸長，且能有效控制早酥梨黑斑病的擴展，其作用效果存在濃度依賴性。進一步研究表明DPA可通過破壞細胞膜的完整性、提高膜通透性、抑制膜組分麥角甾醇的合成和促使膜質(zhì)氧化進而顯著抑制的生長。