羅 青，祿 璐,*，閆亞美，米 佳，李曉鶯，曹有龍，曾曉雄*

（1.國家枸杞工程技術(shù)研究中心，寧夏 銀川 750002；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210018）

枸杞（L.）系茄科枸杞屬落葉灌木，是我國傳統(tǒng)的藥食兩用資源，富含多糖、類胡蘿卜素、酚胺類物質(zhì)及多種微量元素，在抗氧化、抑制腫瘤細胞增殖、提高免疫力、預(yù)防神經(jīng)損傷等方面均有較好效果。目前研究表明，枸杞在調(diào)節(jié)腸道菌群方面也具有積極作用。枸杞子粉對雙歧桿菌和乳酸桿菌等益生菌株有促進作用，且益生元效應(yīng)與枸杞多糖（L.polysaccharides，LBP）、多酚含量密切相關(guān)。LBP能夠促進細胞因子上調(diào)，修護肝損傷，同時促進小鼠與免疫相關(guān)的有益菌群相對豐度增加，從而調(diào)節(jié)小鼠腸道菌群。

近年來，腸道菌群對宿主免疫系統(tǒng)的重要貢獻已經(jīng)引起了廣泛的關(guān)注。腸道菌群失衡與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，并通過刺激免疫反應(yīng)和保持上皮屏障來維持體內(nèi)平衡，因此，腸道菌群穩(wěn)態(tài)對免疫系統(tǒng)和腸道的發(fā)育和維持有重要作用。植物多糖可改善B和T巨噬細胞、淋巴細胞和樹突狀細胞的增殖功能，提高白細胞吞噬能力，抑制脾組織細胞凋亡，促進脾組織白細胞介素（interleukin-1β，IL-1β）基因表達，從而增強機體非特異性免疫功能，同時促進消化酶活性，調(diào)節(jié)腸道菌群組成、維護腸道微生態(tài)健康。但枸杞噴霧干燥粉作為普通食品單一食用或與LBP復(fù)配作為功能性食品對機體免疫系統(tǒng)及腸道菌群的調(diào)節(jié)作用研究鮮有報道。

環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）作為目前世界范圍內(nèi)應(yīng)用最為廣泛的抗腫瘤藥物及免疫抑制劑，在殺傷腫瘤細胞的同時也會破壞機體正常的免疫細胞，啟動炎癥與抗炎反應(yīng)，同時常伴有胃腸道不良反應(yīng)。研究表明，CTX可以改變腸道菌群的組成，多糖則可調(diào)節(jié)被CTX影響的腸道菌群的組成，從而調(diào)節(jié)宿主免疫。

本研究以CTX致免疫低下的小鼠為模型，探尋枸杞粉（L.powder，LB）、LBP及其復(fù)配物對小鼠免疫力及腸道菌群穩(wěn)態(tài)的影響，為枸杞噴霧干燥粉、LBP及其復(fù)配物作為功能性食品等多用途的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

實驗動物均為BALB/c雄性小鼠，4 周齡，體質(zhì)量（20.0f0.5）g，購自南京青龍山動物設(shè)施公司。實驗動物均符合南京動物護理和使用委員會的指導(dǎo)方針，小鼠飼養(yǎng)于SPF級的動物房內(nèi)（溫度24～25℃、相對濕度70%～75%，照明方案為12 h/12 h光暗循環(huán)），由高壓滅菌處理的飲用水和飼料進行喂養(yǎng)。

LB由國家枸杞工程技術(shù)研究中心自制（中國銀川），利用枸杞鮮果經(jīng)清洗、打漿、均質(zhì)、噴霧干燥獲得，經(jīng)檢測多糖質(zhì)量分數(shù)為24.3%；LBP（食品級）購自寧夏沃福百瑞枸杞產(chǎn)業(yè)股份有限公司，經(jīng)檢測多糖質(zhì)量分數(shù)為47.8%；根據(jù)前期實驗，LB與LBP復(fù)配按照2∶1（/）混合均勻，獲得復(fù)配物（LB＋LBP）。

鹽酸左旋咪唑（levamisole hydrochloride，LH）、CTX 上海瑞恩生物技術(shù)有限公司；血清中腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒、IL-1β ELISA試劑盒、干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）ELISA試劑盒、免疫球蛋白A（immunoglobulin A，IgA）ELISA試劑盒 深圳欣博盛科技有限公司；TIANamp Stool DNA提取試劑盒 北京天根生物科技有限公司；MiniBEST universal RNA提取試劑盒、PrimeScript RT master mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒 TaKaRa生物工程有限公司；其他分析純試劑購自上海阿拉丁化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

6890N氣相色譜儀、火焰離子化檢測器、HP-INNOWAX毛細管柱（30 mh0.25 mmh0.25 μm） 美國Agilent公司；QuantStudio 6熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀、NanoDrop 2000超微量分光光度計 美國Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 小鼠處理與分組

將60只小鼠隨機分為6 組（＝10），自由飲水飲食適應(yīng)性飼養(yǎng)一周。除了正常對照（NC）組的10只小鼠不作處理，其他組小鼠在第8、9、10天腹腔內(nèi)注射80 mg/（kggd）的CTX，建立CTX誘導(dǎo)的免疫抑制模型，枸杞噴霧干燥粉組（LB）、LBP組、LB與LBP復(fù)配（LB＋LBP）組及LH組（作為陽性對照）第11～20天按表1每日進行灌胃處理。實驗期間每日觀察干預(yù)后小鼠的神志、精神、食欲、活動等體征，每2 d測定一次體質(zhì)量以及食物消耗量（即采食量），計算體質(zhì)量增長比和采食量，并于第21天早上股動脈采血，收集血樣后，用頸椎脫位法處死小鼠，血液經(jīng)3 000 r/min離心15 min（4 ℃）后收集血清于4 ℃冰箱存放。收集肝臟、盲腸內(nèi)容物、結(jié)腸和糞便在無菌離心管中，并在－80 ℃下保存?zhèn)溆?。實驗期間小鼠飼養(yǎng)采取自由攝食、飲水的原則，并保持自然光照和籠內(nèi)衛(wèi)生清潔。

表1 實驗分組及灌胃處理Table 1 Experimental grouping and intragastrical administration

1.3.2 體質(zhì)量增長比的測定

體質(zhì)量增長比通過式（1）計算。

式中：為上次體質(zhì)量/g；為本次所測體質(zhì)量/g。

1.3.3 臟器指數(shù)的測定

胸腺和脾臟采集后稱質(zhì)量，按以下公式（2）～（3）計算小鼠脾臟指數(shù)與胸腺指數(shù)。

1.3.4 血清細胞因子質(zhì)量濃度測定

股動脈采血，3 000 r/min離心15 min（4 ℃）制備血清，即獲得淋巴細胞懸液，每孔加7.5h10個/mL的淋巴細胞懸液1 mL和刺激原質(zhì)量濃度4 μg/mL刀豆蛋白A（concanavalin A，Con A）稀釋液1 mL，置于37 ℃、5% CO細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72 h，2 500 r/min離心5 min，收集細胞上清液（血清）。按試劑盒說明書操作，采用ELISA法測定小鼠血清IL-1β、TNF-α、IFN-γ及IgA質(zhì)量濃度。

1.3.5 結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)分析

將結(jié)腸用10%福爾馬林溶液固定，石蠟包埋。石蠟切片（厚度5 μm）用蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色。結(jié)腸組織經(jīng)脫水、包埋、切片及HE染色處理后，在光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理情況，并采集圖像。

1.3.6 結(jié)腸組織RNA提取及實時定量PCR分析

采用MiniBEST universal RNA提取試劑盒，從20 mg結(jié)腸樣本中提取總RNA，檢測RNA的濃度和純度。隨后，使用反轉(zhuǎn)錄試劑將500 ng的RNA通過反轉(zhuǎn)錄合成cDNA（37 ℃反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)15 min后，85 ℃反應(yīng)5 s使反轉(zhuǎn)錄酶失活），－80 ℃儲存。準備10 μL的反應(yīng)體系（1 μL引物、4 μL的cDNA和5 μL的SYBR Green Fast Mix試劑），使用QuantStudio 6熒光定量PCR儀進行擴增，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因作為內(nèi)參，目標基因（、、、、、、、和）的相對表達量采用2計算。

1.3.7 盲腸內(nèi)容物和糞便中短鏈脂肪酸含量的測定

取50 mg盲腸內(nèi)容物或糞便與250 μL去離子水混合，以0.2 mol/L鹽酸配制濃度為25 mmol/L的2-乙基丁酸溶液作為內(nèi)標，將150 μL的盲腸內(nèi)容物漿液與150 μL的內(nèi)標溶液混合后，8 000 r/min離心5 min，取上清過膜備用。參照Ding Yu等方法，利用氣相色譜法測定短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）的含量。

1.3.8 腸道菌群分析

采用高通量測序技術(shù)分析LB及LBP對小鼠腸道菌群的影響。根據(jù)DNA提取試劑盒說明書提取小鼠糞便樣品的基因組DNA，所有DNA樣品干冰儲存并運送到杭州聯(lián)川生物科技有限公司進行測序工作。使用的引物擴增引物序列為Primer F：341F（5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’）及Primer R：805R（5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’），對16S rDNA（V3＋V4）可變區(qū)進行PCR。根據(jù)雙端序列的重疊區(qū)，將R1、R2序列拼接成長的標簽序列，并使用cutadapter軟件去除小段序列以及引物序列。然后過濾低質(zhì)量序列，采用Vsearch（v2.3.4）軟件過濾嵌合體。使用DADA2算法進行降噪后，得到特征表和特征序列，分析腸道菌群多樣性、多樣性及組成。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用IBM SPSS Statistics 25軟件進行統(tǒng)計分析，實驗結(jié)果表示為平均值±標準差表示。采用單因素方差分析（ANOVA）和鄧肯檢驗進行顯著性差異分析，＜0.05表示差異顯著。在腸道菌群分析中，多樣性和多樣性通過抽平（將所有樣本的序列數(shù)抽取至最少序列樣本的序列數(shù)）的方式來進行歸一化，物種注釋使用相對豐度來進行歸一化處理，由R（v3.5.2）軟件包繪制圖形。物種注釋采用QIIME2ruNJINO的插件featureclassifier進行序列比對，比對數(shù)據(jù)庫為SILVA和NT-16S數(shù)據(jù)庫，以SILVA數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果為準。采用Tukey HSD檢驗計算兩組間相對豐度的差異（＜0.05）。利用PICRUSt軟件分析來解釋京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）代謝通路，采用STAMP（v2.1.3）軟件通過Welsh’s檢驗（＜0.05）對差異KEGG代謝通路進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對小鼠體質(zhì)量和采食量的影響

如圖1所示，MC組小鼠在用CTX處理后，體質(zhì)量和日采食量均明顯下降，說明造模成功。第9天后，MC組的小鼠體質(zhì)量和日采食量呈現(xiàn)逐漸恢復(fù)的趨勢，但增長緩慢，而LB、LBP及LB＋LBP組，小鼠體質(zhì)量和采食量逐漸趨于NC組和LH組，說明LB、LBP及復(fù)配物均可較好地恢復(fù)小鼠體質(zhì)量和采食量，LBP和LB＋LBP干預(yù)，比LB干預(yù)更能有效地恢復(fù)小鼠的體質(zhì)量。Xia Hui等研究表明服用LBP對健康成年男性的體質(zhì)量及體質(zhì)量指數(shù)并無顯著影響，但可顯著降低血清甘油三酯和高密度脂蛋白指數(shù)。因此，推測可能是通過LBP提高機體免疫力從而恢復(fù)采食量和體質(zhì)量。

圖1 LB、LBP和LB+LBP處理對小鼠體質(zhì)量（A）和日采食量（B）的影響Fig.1 Effects of LB, LBP and LB + LBP on body mass (A) and feed intake (B) of mice

2.2 不同處理對小鼠免疫器官指數(shù)的影響

胸腺和脾臟是機體的主要免疫器官，其質(zhì)量的改變可以反映受試藥物對免疫系統(tǒng)的刺激作用，因此，胸腺和脾臟指數(shù)被認為是反映免疫功能的重要指標。由圖2可知，與NC組相比，MC組的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均顯著下降（＜0.05），說明CTX可以誘導(dǎo)小鼠免疫低下。與MC組比較，LB、LBP和LB＋LBP組的小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)顯著升高（＜0.05），說明LB、LBP和LB＋LBP混合干預(yù)均對CTX所致的小鼠脾臟、胸腺損傷有一定的改善作用。與LB干預(yù)相比，LBP和LB＋LBP混合干預(yù)能更有效地改善小鼠脾臟和胸腺損傷，且與NC組相比無顯著性差異（＞0.05）。其中LB＋LBP組對小鼠脾臟損傷的恢復(fù)效果比LBP組好，但對于胸腺指數(shù)，LB組和LB＋LBP組之間沒有顯著差異（＞0.05）。

圖2 LB、LBP和LBLBP處理對小鼠脾臟指數(shù)（A）和胸腺指數(shù)（B）的影響Fig.2 Effects of LB, LBP and LB + LBP on spleen index (A) and thymus index (B) of mice

2.3 不同處理對小鼠血清中細胞因子和IgA產(chǎn)生量的影響

細胞因子大多是一些小分子可溶性蛋白質(zhì)，通過刺激免疫細胞及某些非免疫細胞合成釋放，可以直接參與多種免疫功能。此外，研究表明巨噬細胞可通過各種受體與多糖或糖蛋白結(jié)合，從而分泌細胞因子如IL-1β和TNF-α以殺死腫瘤細胞。通常CTX的誘導(dǎo)可導(dǎo)致小鼠體內(nèi)白細胞比例失衡，增加中性粒細胞、單核細胞及嗜酸性粒細胞比例，減少淋巴細胞比例。如圖3所示，與NC組相比，MC組小鼠血清中細胞因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ和免疫球蛋白IgA的質(zhì)量濃度顯著下降（＜0.05）；與MC組比較，LB、LBP、LB+LBP組小鼠血清中TNF-α、IFN-γ、IL-1β和IgA質(zhì)量濃度均顯著上調(diào)（＜0.05），與Ding Yu等發(fā)現(xiàn)利用LBP可促進免疫低下小鼠細胞因子分泌的結(jié)果一致。本實驗結(jié)果表明，LB、LBP及LB＋LBP均可促進CTX致免疫抑制型小鼠分泌細胞因子，從而增強小鼠非特異性免疫應(yīng)答。還有學(xué)者通過將枸杞與脫脂乳均質(zhì)添加在小鼠的日常飲食中來促進小鼠T細胞增殖，從而提高小鼠免疫應(yīng)答，降低流感感染率。

圖3 LB、LBP和LBLBP處理對血清中細胞因子TNF-α（A）、IFN-γ（B）、IL-1β（C）和IgA（D）質(zhì)量濃度的影響Fig.3 Effects of LB, LBP and LB + LBP on serum levels of TNF-α(A),IFN-γ (B), IL-1β (C) and IgA (D)

2.4 不同處理對小鼠結(jié)腸組織的影響

光學(xué)顯微鏡下小鼠結(jié)腸組織形態(tài)如圖4所示。NC組小鼠結(jié)腸組織具有完整的結(jié)腸黏膜、隱窩、皺褶，且結(jié)構(gòu)整齊，排列緊密。而MC組結(jié)腸黏膜損傷較嚴重，伴有隱窩增生、上皮細胞損傷和基底淋巴聚集現(xiàn)象。而通過LB、LBP、LB＋LBP和LH的干預(yù)，結(jié)腸組織形態(tài)恢復(fù)較好，幾乎接近NC組，且LBP和LB＋LBP組杯狀細胞數(shù)量明顯增加，杯狀細胞可促進分泌黏蛋白，形成黏膜屏障。因此，LB、LBP和LB＋LBP干預(yù)可明顯改善CTX誘導(dǎo)的結(jié)腸組織損傷，進而改善腸道屏障功能。

圖4 LB、LBP和LBLBP處理組小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)觀察（×20）Fig.4 Histopathological observation of colon sections of mice treated with LB, LBP and LB + LBP (× 20)

2.5 不同處理對小鼠結(jié)腸相關(guān)基因表達的影響

如圖5所示，與NC組相比，CTX可顯著降低結(jié)腸中、、、、、、和的表達水平（＜0.05）。與MC組相比，LB干預(yù)顯著提高了結(jié)腸中細胞因子的表達量（＜0.05），LBP干預(yù)顯著提高了、及SCFAs受體的表達量（＜0.05）；LB＋LBP干預(yù)顯著提高了、、和的表達量；LH干預(yù)顯著提高了、、、、的表達量。緊密連接蛋白和表達水平的降低與屏障功能障礙和腸上皮細胞旁通透性的增加密切相關(guān)，對維持腸道屏障功能具有重要作用。MUC2是一種黏蛋白，由結(jié)腸杯狀細胞產(chǎn)生，在細菌攻擊時可保護宿主組織免于暴露。以上結(jié)果表明，LBP作為枸杞中的重要的活性成分比LB更有效提高結(jié)腸中上述基因的表達，且LB＋LBP混合干預(yù)對、、和的提高作用優(yōu)于單獨LBP干預(yù)，推測LB和LBP在提高結(jié)腸相關(guān)基因表達方面可能存在協(xié)同效應(yīng)。

圖5 LB、LBP和LBLBP處理對小鼠結(jié)腸中基因ZO-1（A）、Occludin（B）、Claudin-1（C）、MUC2（D）、GPR41（E）、GPR43（F）、TNF-α（G）、IFN-γ（H）和IL-6（I）相對表達量的影響Fig.5 Effects of LB, LBP and LB + LBP on relative expression levels of ZO-1 (A), Occludin (B), Claudin-1 (C), MUC2 (D), GPR41 (E), GPR43 (F),TNF-α (G), IFN-γ (H) and IL-6 (I) in the colon of mice

2.6 不同處理對小鼠盲腸內(nèi)容物和糞便中SCFAs的影響

SCFAs是腸道菌群的主要代謝產(chǎn)物，在維持腸道正常功能和結(jié)腸上皮細胞的形態(tài)和功能方面發(fā)揮著重要的作用。如表2所示，與NC組相比，MC組的盲腸內(nèi)容物和糞便中SCFAs的含量均明顯下降。與MC組相比，LB、LBP、LB＋LBP和LH干預(yù)后，小鼠盲腸內(nèi)容物和糞便中SCFAs含量得到了不同程度的提高。與MC組相比，LB干預(yù)整體上顯著提高了盲腸內(nèi)容物和糞便中各SCFAs和總SCFAs含量（＜0.05）；LBP干預(yù)顯著提高了盲腸內(nèi)容物中丙酸、正丁酸、正戊酸和異戊酸的含量以及糞便中乙酸、丙酸、正丁酸、正戊酸、異戊酸和總SCFAs的含量（＜0.05）；LB＋LBP干預(yù)顯著提高了盲腸內(nèi)容物中丙酸、正丁酸、正戊酸和異戊酸的含量以及糞便中丙酸、正戊酸、異戊酸和總SCFAs的含量（＜0.05），因此，LB對促進小鼠腸道菌群代謝具有顯著的積極作用。研究表明，SCFAs可以在各種細胞途徑中充當信號分子，乙酸、丙酸和丁酸與SCFAs受體GPR41、GPR43和GPR109A密切相關(guān)，GPR41和GPR43可激活上皮細胞的細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2和p38促分裂原活化蛋白激酶信號通路，促進趨化因子和細胞因子的產(chǎn)生。因此，LB、LBP、LB＋LBP可能通過激活免疫相關(guān)途徑從而促進腸道菌群產(chǎn)生SCFAs。

表2 小鼠盲腸和糞便中SCFAs含量Table 2 Effects of LB, LBP and LB + LBP on contents of SCFAs in cecum and feces of mice

2.7 不同處理對CTX誘導(dǎo)小鼠腸道菌群的調(diào)節(jié)作用

2.7.1 腸道菌群多樣性分析

多樣性指數(shù)可評估腸道菌群的豐富性和多樣性。如圖6A～C所示，與NC組相比，MC組中Chao1指數(shù)顯著降低（＜0.05），而與MC組相比，除了LB組的Simpson指數(shù)不存在顯著差異外，LB、LBP組和LB＋LBP組的Chao1、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均顯著升高（＜0.05），說明LB、LBP和LB＋LBP處理均可提高腸道菌群多樣性。多樣性可度量不同樣本間菌群組成的相似度。如圖6D、E所示，MC組腸道菌群組成與其他各組存在明顯差異，說明CTX誘導(dǎo)免疫抑制小鼠，其腸道菌群組成發(fā)生了明顯變化，NC、LB、LBP、LB＋LBP和LH組樣本間的距離相近，表明通過LB、LBP和LB＋LBP干預(yù)可促進免疫抑制小鼠腸道菌群恢復(fù)正常。

圖6 小鼠腸道菌群α多樣性和β多樣性分析Fig.6 Alpha-diversity index and β-diversity index analysis of gut microbiota

2.7.2 小鼠腸道菌群組成分析

如圖7所示，所有組的小鼠腸道菌群主要由擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）組成，占菌落總數(shù)的90%以上，其次是-變形菌門（Epsilonbacteraeota）和變形菌門（Proteobacteria）。與MC組相比，LB、LBP和LB＋LBP干預(yù)能夠顯著增加Bacteroidetes相對豐度（＜0.05），同時顯著減少Firmicutes、Epsilonbacteraeota和Proteobacteria的相對豐度（＜0.05），與Ding Yu、聶啟興、Tian Baoming、Huang Kaiyin等的研究結(jié)果一致，表明LB、LBP、LB＋LBP干預(yù)可顯著降低Firmicutes/Bacteroidetes（F/B）比例。LBP可能是降低F/B比例的主要功效成分。

圖7 小鼠腸道菌群門水平上的相對豐度分布和主要門的相對豐度Fig.7 Relative abundance of gut microbiota at phylum level and relative abundance of major phyla

在科水平上，檢測出小鼠的腸道菌群主要由12個菌科組成，如圖8A所示，其中Muribaculaceae的相對豐度最高。與NC組相比，MC組小鼠腸道菌群中Muribaculaceae和Prevotellaceae的相對豐度顯著降低（＜0.05），Lachnospiraceae、Helicobacteraceae、Ruminococcaceae、Clostridiales_unclaasified、Desulfovibrionaceae、Deferribacteraceae的相對豐度顯著增加（＜0.05）。與MC組相比，LB、LBP、LB＋LBP及LH干預(yù)后可顯著增加Muribaculaceae的相對豐度（＜0.05），略增加Prevotellaceae的相對豐度，同時顯著抑制Lachnospiraceae、Helicobacteraceae、Ruminococcaceae、Clostridiales_unclaasified（除LBP組）、Desulfovibrionaceae、Deferribacteraceae相對豐度（＜0.05）（圖8B～I）。目前研究認為，Prevotellaceae是腸道內(nèi)促SCFAs產(chǎn)生的菌屬，也是腸道微生物水解膳食纖維的關(guān)鍵成員，其相對豐度與TGF-β3有關(guān)，而TGF-β3是一種能調(diào)節(jié)腸道屏障功能的細胞因子，對于腸道菌群的健康恢復(fù)具有重要作用。Desulfovibrionaceae可產(chǎn)生細胞毒性化合物硫化氫，破壞腸上皮細胞并誘導(dǎo)黏膜啟動炎癥反應(yīng)。Huang Kaiyin等采用CTX誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎模型致使小鼠結(jié)腸內(nèi)Muribaculaceae、Saccharimonadaceae、Peptococcaceae相對豐度下調(diào)，而Rikenellaceae、Lactobacillaceae、Helicobacteraceae、Bacteroidaceae、Marinifilaceae、Deferribacteraceae、Tannerellaceae、Enterobacteriaceae、Streptococcaceae的相對豐度均上調(diào)；Ding Yu等通過LBP的干預(yù)也可顯著提高CTX誘導(dǎo)的小鼠腸道中Lachnospiraceae、Ruminococcaceae、Deferribacteraceae、Desulfovibrionaceae、Anaeroplasmataceae的相對豐度，與本實驗結(jié)果相近。

圖8 科水平上腸道微生物相對豐度與主要科水平的比較分析Fig.8 Relative abundance of gut microbiota at family level and comparative analysis of relative abundance of major families

如圖9所示，在由CTX誘導(dǎo)改變小鼠腸道菌群組成中，可被LB、LBP、LB＋LBP調(diào)節(jié)的菌屬包括11種_unclassified、7種、2種、1種、1種、2種_unclassified，其中18種菌屬相對豐度增加（_unclassified、），6種菌屬相對豐度減少（、、、_unclassified）。本實驗從小鼠糞便中檢測出眾多可被LB、LBP、LB＋LBP調(diào)節(jié)的Muribaculaceae細菌群，研究表明，Muribaculaceae屬于擬桿菌門（Bacteroidetes），在小鼠腸道菌群中占主導(dǎo)地位，由于它們的培養(yǎng)時間較晚，家族分類還不明確，其相對豐度與丙酸含量有很強的相關(guān)性，是Spalax鼠長壽相關(guān)的主要細菌類群。此外，相較于LBP干預(yù)，LB、LB＋LBP干預(yù)能夠降低產(chǎn)毒素Clostridiales相對豐度，增加有益菌的相對豐度，LB＋LBP干預(yù)則可降低厭氧菌的相對豐度。Clostridiales的分布、表達與腹瀉型胃腸疾病患者的腸道菌組成、SCFAs水平密切相關(guān)，是腸易激綜合征潛在的生物標志物。、在正常小鼠體內(nèi)碳水化合物代謝的表達較高，在高膳食膽固醇導(dǎo)致小鼠脂肪變性、脂肪性肝炎、肝纖維化的實驗中，腸道、和在不同階段明顯聚集，且相對豐度依次增加。因此，LB、LB＋LBP還調(diào)節(jié)了與糖脂代謝相關(guān)菌群的相對豐度。

圖9 小鼠腸道菌群組成Fig.9 Composition of gut microbiota

采用PICRUSt軟件進行KEGG代謝通路富集分析，與NC組相比，MC組小鼠由于CTX誘導(dǎo)共有29 條通路（22 條富集，7 條缺失）發(fā)生改變。CTX處理導(dǎo)致富集的通路經(jīng)過LB、LBP、LB＋LBP干預(yù)后明顯減少，如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、環(huán)境適應(yīng)、細胞運動、膜轉(zhuǎn)運、轉(zhuǎn)錄、異種生物降解和代謝等，CTX處理導(dǎo)致缺失的通路經(jīng)過LB、LBP、LB＋LBP干預(yù)后富集，如免疫系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、能量代謝、氨基酸代謝等，此外，碳水化合物代謝和脂代謝也都富集。因此，通過LB、LBP、LB＋LBP干預(yù)不僅逆轉(zhuǎn)了由CTX處理改變的腸道菌群代謝功能異常，并使其趨于NC組，還調(diào)節(jié)了碳水化合物代謝和脂代謝，表明LB、LBP及LB＋LBP在調(diào)節(jié)糖脂代謝菌群具有潛在功效。

3 結(jié) 論

LB、LBP及其復(fù)配物（LB＋LBP）均可不同程度地恢復(fù)免疫抑制小鼠的體質(zhì)量和采食量，改善小鼠的脾臟和胸腺損傷，有效促進免疫抑制小鼠細胞因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ和IgA的分泌，調(diào)節(jié)結(jié)腸中免疫相關(guān)基因的表達，促進SCFAs的產(chǎn)生，顯著調(diào)節(jié)_unclassified、、、、、等菌的相對豐度（＜0.05），逆轉(zhuǎn)腸道菌群代謝功能異常，并使其趨于正常。但相較于LBP，LB、LB＋LBP還可降低產(chǎn)毒素Clostridiales相對豐度，增加有益菌的相對豐度，LB＋LBP還可降低厭氧菌的相對豐度，是潛在益生元的良好來源。本研究結(jié)果將為開拓多元化枸杞產(chǎn)品及研發(fā)功效針對性的枸杞健康產(chǎn)品和提供理論依據(jù)。