程芬 楊長(zhǎng)花 宋艷麗 杜蓓 劉峰 胡本祥

關(guān)鍵詞鹽炙杜仲;腎陽(yáng)虛;大鼠;缺氧誘導(dǎo)因子1α;信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子5

腎陽(yáng)虛是我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的常見證型之一，多與素體陽(yáng)虛、年老腎虧、久病不愈等因素密切相關(guān)[1]。研究發(fā)現(xiàn)，腎陽(yáng)虛會(huì)導(dǎo)致患者出現(xiàn)骨質(zhì)疏松、軟骨退變及生殖能力減退等多種病理性改變，如不及時(shí)治療會(huì)嚴(yán)重影響其生活質(zhì)量[2]。目前，臨床尚無針對(duì)腎陽(yáng)虛的系統(tǒng)治療藥物，只能進(jìn)行基礎(chǔ)的對(duì)癥治療，所以相關(guān)治療藥物的研發(fā)是當(dāng)前工作重點(diǎn)[1]。中醫(yī)理論認(rèn)為，腎主水，腎陽(yáng)虛的臨床表現(xiàn)主要呈小便清長(zhǎng)等特征，故有學(xué)者結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為，腎陽(yáng)虛與腎組織病理學(xué)變化有關(guān)[3]。杜仲可通過增強(qiáng)或提高腎陽(yáng)虛小鼠抓力、肛溫、自主活動(dòng)能力、睪丸和精囊腺指數(shù)，延長(zhǎng)其游泳時(shí)間，降低其血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、血肌酐（serum creatinine，SCR）水平，改善其血液學(xué)指標(biāo)來改善其腎陽(yáng)虛證之腰膝酸軟、性欲減退、畏寒、肢冷、精神萎靡、陽(yáng)虛水泛以及腎精虧虛、肝氣虛弱所致的血液虧虛[4]。鹽炙杜仲對(duì)大鼠去卵巢所引起的骨質(zhì)疏松癥有良好的干預(yù)作用，且鹽制品效果優(yōu)于生品[5]。杜仲鹽炙后，能改變其大多數(shù)化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)，增加親脂性，從而促進(jìn)其體內(nèi)吸收，提高生物利用度[6]。然而目前鹽炙杜仲在腎陽(yáng)虛方面的藥理作用及機(jī)制尚不明確。有研究報(bào)道，缺氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子5（signal transducer and activator of transcription5，STAT5）信號(hào)通路及相關(guān)蛋白的表達(dá)變化與腎陽(yáng)虛的發(fā)病機(jī)制及患者預(yù)后密切相關(guān)，調(diào)控HIF-1 α和STAT5 蛋白的表達(dá)可能是治療腎陽(yáng)虛的重要途徑和方法[7-8]?；诖耍狙芯繑M初步探討鹽炙杜仲對(duì)腎陽(yáng)虛大鼠的干預(yù)作用及潛在機(jī)制，為鹽炙杜仲藥理作用的深入研究及腎陽(yáng)虛治療藥物的研發(fā)提供新的思路和參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括SD1-BS 型全自動(dòng)生化分析儀（成都斯馬特科技公司）、Axio Imager M2m型倒置顯微鏡（德國(guó)Carl Zeiss 公司）、ChemiDoc XRS型凝膠成像儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）、ST-960 型多功能酶標(biāo)儀（上海科華實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司）、GL-20MS型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）、DYCZ-30C型雙垂直電泳槽（北京海天友誠(chéng)科技公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

鹽炙杜仲（北京同仁堂制藥有限公司，批號(hào)1908161），經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院胡本祥教授鑒定為杜仲科植物杜仲Eucommia ulmoides Oliv.干燥樹皮的鹽制品;桂附地黃片[陽(yáng)性對(duì)照藥，批號(hào)1806192，規(guī)格0.4 g（相當(dāng)于總藥材1 g）]購(gòu)自太極集團(tuán)重慶桐君閣藥廠有限公司;磷酸腺嘌呤片（批號(hào)1811271，規(guī)格10 mg）購(gòu)自天津力生制藥股份有限公司;超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)S0103）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)S0131M）、睪酮（testosterone，T）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA）試劑盒（貨號(hào)PT872）、RIPA蛋白裂解液（貨號(hào)P0013B）、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（貨號(hào)P0018M）、兔源HIF-1 α多克隆抗體（貨號(hào)PT872）、兔源甘油醛-3- 磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）單克隆抗體（貨號(hào)AF7087）、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）二抗（貨號(hào)A0208）均購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司;皮質(zhì)醇（cortisol，COR）ELISA 試劑盒（貨號(hào)KB3114）購(gòu)自上海恪敏生物科技有限公司;兔源STAT5 及磷酸化STAT5（phosphorylatedSTAT5，p-STAT5）多克隆抗體（ 貨號(hào)分別為ab16276、ab178941）均購(gòu)自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司;蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染液試劑盒（貨號(hào)G1120）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;RNA提取試劑盒（貨號(hào)WLA088）、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）試劑盒（貨號(hào)WLA071）均購(gòu)自沈陽(yáng)萬類生物科技有限公司;其余試劑均為分析純或?qū)嶒?yàn)室常用規(guī)格，水為蒸餾水。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)雄性SD 大鼠共90 只，6～8 周齡，體質(zhì)量為180～200 g，購(gòu)自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，使用許可證號(hào)為SYXK（陜）2018-001。所有大鼠均飼養(yǎng)在溫度（22±2）℃、相對(duì)濕度40%～60%的動(dòng)物房?jī)?nèi)，自由攝食、飲水。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)陜西國(guó)際商貿(mào)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意，批準(zhǔn)號(hào)為201940。

2 方法

2.1 鹽炙杜仲混懸液的制備

取鹽炙杜仲300 g，粉碎，得粗粉，取適量，置于60%乙醇1 000 mL中，回流提取1.5 h×2 次，合并提取液，加熱濃縮制成質(zhì)量濃度為3 g/mL（以生藥量計(jì)）的浸膏，備用。使用時(shí)，將上述浸膏用水稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.6、0.3、0.15 g/mL（以生藥量計(jì)）的混懸液。

2.2 造模與給藥

90 只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，稱定其體質(zhì)量（記為W1）。按體質(zhì)量均衡和隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組（15 只）和造模組（75 只）。除正常對(duì)照組外，其余大鼠每天上午灌胃腺嘌呤250 mg/kg 建立腎陽(yáng)虛大鼠模型，連續(xù)給藥14 d[9]。根據(jù)中醫(yī)理論觀察大鼠是否出現(xiàn)如下癥狀：（1）精神萎靡、畏寒;（2）活動(dòng)減少、蜷縮抱團(tuán);（3）大便溏稀、小便清長(zhǎng)、肛周污穢;（4）體毛疏松、黯淡無光等。根據(jù)上述癥狀對(duì)各組大鼠腎陽(yáng)虛癥候進(jìn)行評(píng)分：未出現(xiàn)以上癥狀記0 分，出現(xiàn)1 項(xiàng)癥狀記1 分，出現(xiàn)2 項(xiàng)癥狀記2 分，出現(xiàn)3 項(xiàng)癥狀記3 分，出現(xiàn)4 項(xiàng)癥狀記4 分;以大鼠腎陽(yáng)虛癥候評(píng)分大于0 分并伴有血清T 水平降低、COR水平升高視為造模成功[10]。造模完成后，將造模組大鼠隨機(jī)分為模型組、陽(yáng)性對(duì)照組和鹽炙杜仲低、中、高劑量組，每組15 只。陽(yáng)性對(duì)照組大鼠灌胃桂附地黃片混懸液2.5 g/kg（溶劑為水）[9]，鹽炙杜仲低、中、高劑量組大鼠分別灌胃鹽炙杜仲混懸液1.5、3、6 g/kg[11]，正常對(duì)照組和模型組大鼠灌胃生理鹽水，每天1 次，連續(xù)給藥8周[10]。給藥結(jié)束后，對(duì)各組大鼠的腎陽(yáng)虛癥候進(jìn)行評(píng)分并再次稱定其體質(zhì)量（記為W2）。

2.3 大鼠血清中BUN、SCR、T、COR水平測(cè)定

取材前，大鼠禁食不禁水12 h。末次給藥1 h 后，取大鼠眼眶靜脈叢血，于4 ℃下靜置4 h 后，以3 500 r/min離心10 min，取上清液，用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清中BUN、SCR水平;嚴(yán)格按照ELISA 試劑盒說明書方法操作，檢測(cè)血清中T、COR水平。

2.4 大鼠腎組織病理學(xué)檢查

取血后，大鼠頸椎脫臼處死，取腎組織適量，用中性甲醛固定后，浸蠟、切片（厚度5 μm），常規(guī)HE染色后，使用倒置顯微鏡觀察其腎組織病理學(xué)變化。

2.5 大鼠腎組織中SOD活性、MDA水平檢測(cè)

取大鼠腎組織適量，嚴(yán)格按照試劑盒說明書方法操作，以WST-8 法檢測(cè)各組大鼠腎組織中SOD活性，顯色法檢測(cè)腎組織中MDA水平。

2.6 大鼠腎組織中HIF-1α、STAT5 mRNA表達(dá)檢測(cè)

取大鼠腎組織適量，提取總RNA 后，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用熒光定量PCR 法檢測(cè)其HIF-1 α 、STAT5mRNA的表達(dá)水平。PCR 反應(yīng)體系（20 μL）包含cDNA模版2 μL，PCR Master Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，用無菌水補(bǔ)足20 μL。反應(yīng)條件如下：94 ℃預(yù)變性3min;94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)。引物由賽默飛世爾科技有限公司設(shè)計(jì)、合成，其具體序列和擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度見表1。以β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算HIF-1α、STAT5 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

2.7 大鼠腎組織中HIF-1α、STAT5蛋白表達(dá)檢測(cè)

采用Western blot 法進(jìn)行檢測(cè)。取大鼠腎組織適量，經(jīng)RIPA蛋白裂解液提取總蛋白后，按BCA法定量，然后加熱變性，取變性后的蛋白樣品50 μg 進(jìn)行電泳分離，隨后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上，用脫脂牛奶于室溫下封閉2 h 后，置于4 ℃ 冰箱中，加入HIF-1 α 、STAT5、p-STAT5、GAPDH 一抗（稀釋比例均為1 ∶ 500），孵育過夜;使用PBST 緩沖液清洗3 次，共15 min，加入相應(yīng)二抗（稀釋比例為1 ∶1 000），室溫孵育1 h，用PBST緩沖液清洗3 次，以ECL 顯色后，于凝膠成像儀上成像并使用Image J 1.52v 軟件分析蛋白灰度值，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白（GAPDH）的灰度值比值為該蛋白的相對(duì)表達(dá)量，以p-STAT5 與STAT5 的灰度值比值（p-STAT5/STAT5）評(píng)價(jià)STAT5蛋白的磷酸化水平。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 20.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料（符合正態(tài)分布）以x±s 表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 大鼠體質(zhì)量變化及腎陽(yáng)虛癥候評(píng)分

鹽炙杜仲對(duì)大鼠體質(zhì)量及腎陽(yáng)虛癥候評(píng)分的影響見表2。由表2 可見，造模前，各組大鼠體質(zhì)量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。給藥結(jié)束后，模型組大鼠的體質(zhì)量較正常對(duì)照組顯著降低（P<0.05），腎陽(yáng)虛癥候評(píng)分顯著升高（P<0.05）;鹽炙杜仲各劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠的體質(zhì)量均較模型組顯著升高（P<0.05），腎陽(yáng)虛癥候評(píng)分均顯著降低（P<0.05），且鹽炙杜仲的上述作用有劑量依賴性（P<0.05）。

3.2 大鼠血清中BUN、SCR、T、COR水平變化

鹽炙杜仲對(duì)腎陽(yáng)虛大鼠血清中BUN、SCR、T、COR水平的影響見表3。由表3 可見，模型組大鼠血清中BUN、SCR、COR 水平均較正常對(duì)照組顯著升高（P<0.05），T水平顯著降低（P<0.05）;鹽炙杜仲各劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠血清中BUN、SCR、COR水平均較模型組顯著降低（P<0.05），T水平均顯著升高（P<0.05），且鹽炙杜仲的上述作用有劑量依賴性（P<0.05）。

3.3 大鼠腎組織病理變化

各組大鼠腎組織病理檢查的顯微圖見圖1。由圖1可見，正常對(duì)照組大鼠腎組織細(xì)胞排列整齊，未見明顯病理改變;與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠腎小管壞死，腎小球數(shù)量減少、囊腔增大，炎癥細(xì)胞增生;與模型組比較，鹽炙杜仲各劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠腎小球及腎小管的病理改變均有所恢復(fù)，腎組織細(xì)胞排列均較為整齊，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)均明顯減輕。

3.4 大鼠腎組織中SOD活性、MDA水平變化

鹽炙杜仲對(duì)腎陽(yáng)虛大鼠腎組織中SOD活性、MDA水平的影響見表4。由表4 可見，模型組大鼠腎組織中SOD活性較正常對(duì)照組顯著降低（P<0.05），MDA水平顯著升高（P<0.05）;鹽炙杜仲各劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠腎組織中SOD 活性均較模型組顯著升高（P<0.05），MDA水平均顯著降低（P<0.05），且鹽炙杜仲的上述作用有劑量依賴性（P<0.05）。

3.5 大鼠腎組織中HIF-1α、STAT5 mRNA相對(duì)表達(dá)量變化

鹽炙杜仲對(duì)腎陽(yáng)虛大鼠腎組織中HIF-1α、STAT5mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響見表5。由表5 可見，模型組大鼠腎組織中HIF-1α、STAT5 mRNA的相對(duì)表達(dá)量均較正常對(duì)照組顯著升高（P<0.05）;鹽炙杜仲各劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠腎組織中HIF-1α、STAT5 mRNA的相對(duì)表達(dá)量均較模型組顯著降低（P<0.05），且鹽炙杜仲的上述作用有劑量依賴性（P<0.05）。

3.6 大鼠腎組織中HIF-1α、STAT5蛋白表達(dá)變化

各組大鼠腎組織中HIF-1α、STAT5、p-STAT5 蛋白表達(dá)的電泳圖見圖2，鹽炙杜仲對(duì)腎陽(yáng)虛大鼠腎組織中HIF-1 α、STAT5、p-STAT5 蛋白相對(duì)表達(dá)量和p-STAT5/STAT5 的影響見表6。由圖2、表6 可見，模型組大鼠腎組織中HIF-1α、STAT5、p-STAT5 蛋白的相對(duì)表達(dá)量和p-STAT5/STAT5 均較正常對(duì)照組顯著升高（P<0.05）;鹽炙杜仲各劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠腎組織中HIF-1α、STAT5、p-STAT5 蛋白的相對(duì)表達(dá)量和p-STAT5/STAT均較模型組顯著降低（P<0.05），且鹽炙杜仲的上述作用有劑量依賴性（P<0.05）。

4 討論

中醫(yī)理論認(rèn)為，腎陽(yáng)虛是由機(jī)體腎陽(yáng)虛衰、溫煦失職、氣化失權(quán)等病因所導(dǎo)致的畏寒怕冷、精神不振等一系列癥候[12-13]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，腎陽(yáng)虛發(fā)病機(jī)制與腦、腎、性腺等組織器官神經(jīng)內(nèi)分泌紊亂等因素相關(guān)[14]。腺嘌呤致腎陽(yáng)虛是目前實(shí)驗(yàn)室常用的腎陽(yáng)虛動(dòng)物模型建立方法，經(jīng)實(shí)踐證實(shí)，該方法具有操作簡(jiǎn)便、安全性及重復(fù)性較好的優(yōu)點(diǎn)[15]。桂附地黃片是臨床應(yīng)用較為廣泛的腎陽(yáng)虛治療藥物，故本研究將其作為陽(yáng)性對(duì)照藥。

杜仲為杜仲科植物杜仲E. ulmoides Oliv.的干燥樹皮，最早記載于我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)著作《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有強(qiáng)筋壯骨、補(bǔ)益肝腎等功效，可用于治療腎陽(yáng)虛致腰膝酸痛等癥[16]。鹽炙杜仲是杜仲藥材經(jīng)一系列加工工藝所制得的中藥炮制品，與傳統(tǒng)杜仲藥材相比，鹽炙杜仲具有更強(qiáng)的抗氧化能力，并可緩和生品藥性[17]。

腎陽(yáng)虛癥候評(píng)分是研究者對(duì)腎陽(yáng)虛大鼠造模效果評(píng)價(jià)及藥效學(xué)評(píng)價(jià)的重要手段之一[18]。BUN、SCR水平是反映腎功能的重要指標(biāo)，其水平升高提示腎功能下降[19]。近年來有學(xué)者提出，下丘腦-垂體-性腺軸相關(guān)激素水平能夠反映腎陽(yáng)虛疾病狀態(tài)及病情進(jìn)展，血清中T、COR水平是下丘腦-垂體-性腺軸相關(guān)激素的代表，血清中T 水平降低及COR水平升高則是腎陽(yáng)虛的重要表現(xiàn)之一[20]。本研究結(jié)果表明，與模型組比較，鹽炙杜仲各劑量組大鼠腎小球及腎小管的病理改變均有所恢復(fù)，其腎陽(yáng)虛癥候評(píng)分和血清中BUN、SCR、COR水平均顯著降低，血清中T 水平均顯著升高，且鹽炙杜仲的上述作用有劑量依賴性，提示該炮制品能劑量依賴性地改善腺嘌呤誘導(dǎo)的大鼠腎組織病理改變和下丘腦-垂體-性腺軸相關(guān)激素水平。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α與腎陽(yáng)虛的發(fā)病機(jī)制及疾病進(jìn)展密切相關(guān)[21]。陳琪琪等[22]研究顯示，腺嘌呤會(huì)引發(fā)大鼠腎動(dòng)脈血管鈣化、腎小球萎縮及腎間質(zhì)纖維化等腎組織病理改變，其機(jī)制可能與HIF-1α水平升高有關(guān);孔翠文等[23]研究顯示，腺嘌呤可誘導(dǎo)大鼠腎組織缺氧損傷、腎纖維化改變以及腎組織中HIF-1α水平升高;賈云波等[24]研究顯示，降低HIF-1α水平能夠有效改善腎陽(yáng)虛大鼠的血瘀證。STAT5 蛋白在生殖細(xì)胞發(fā)育和性激素水平調(diào)節(jié)的過程中有重要意義，其表達(dá)的上調(diào)會(huì)造成機(jī)體性激素水平的異常[25]。本研究結(jié)果表明，經(jīng)鹽炙杜仲干預(yù)后，腎陽(yáng)虛大鼠腎組織中HIF-1α、STAT5 mRNA及HIF-1α、STAT5、p-STAT5 蛋白的相對(duì)表達(dá)量和p-STAT5/STAT5 均顯著降低，表明鹽炙杜仲不僅能顯著降低HIF-1α水平，還能夠顯著降低STAT5 蛋白的表達(dá)水平及其磷酸化水平，提示鹽炙杜仲對(duì)腎陽(yáng)虛大鼠的改善作用可能是通過下調(diào)HIF-1α和STAT5蛋白的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。

SOD及MDA是體現(xiàn)抗氧化應(yīng)激能力的指標(biāo)。研究表明，SOD活性降低、MDA水平升高均會(huì)導(dǎo)致腎組織處于氧化應(yīng)激損傷狀態(tài)，同時(shí)導(dǎo)致腎組織中HIF-1α水平升高[26];馮杰等[27]研究顯示，抑制MDA的產(chǎn)生和增強(qiáng)SOD的活性，可抑制腎組織中HIF-1α的表達(dá)水平，從而修復(fù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的腎組織損傷。本研究結(jié)果表明，不同劑量的鹽炙杜仲均能增強(qiáng)大鼠腎組織中SOD活性并降低MDA水平，提示鹽炙杜仲能夠通過提高大鼠的抗氧化應(yīng)激能力進(jìn)而修復(fù)腎陽(yáng)虛大鼠的腎組織損傷，同時(shí)抑制HIF-1α的表達(dá)。

綜上所述，鹽炙杜仲能夠明顯緩解腎陽(yáng)虛大鼠的腎組織損傷，降低血清中BUN、SCR、COR水平，升高血清中T 水平，其機(jī)制可能與抗氧化應(yīng)激、抑制HIF-1 α和STAT5 蛋白的表達(dá)有關(guān)。