丁曉妍，崔明全，李 霆，朱馨樂，張純萍，程 敏，趙 琪，王鶴佳

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

我國是畜牧業(yè)大國，涉及動物種類繁多，養(yǎng)殖基數(shù)大，需要獸用抗菌藥物為動物健康和食品安全保駕護航?？墒请S著抗菌藥物的廣泛使用，“細菌耐藥性出現(xiàn)→過量使用或濫用抗菌藥物→耐藥譜或耐藥水平加重”的惡性循環(huán)仍在繼續(xù)[1]。為了遏制動物源細菌耐藥性，2018年，我國開始開展獸用抗菌藥使用減量化行動試點，其中，相關(guān)養(yǎng)殖場細菌流行和耐藥情況備受關(guān)注[2]。大腸桿菌和腸球菌分別被認定為革蘭氏陰性和革蘭氏陽性耐藥水平指示菌[3]，耐藥性水平指示菌在一定程度上代表了該養(yǎng)殖場的細菌耐藥水平，是細菌耐藥性監(jiān)測中關(guān)注的重要對象。目前，我國動物源細菌耐藥性監(jiān)測中細菌分離鑒定多采用生化和PCR鑒定方法[4]。針對不同養(yǎng)殖場不同類型的細菌分別鑒定，程序不一，工作量大，迫切需求高效的細菌鑒定技術(shù)手段?；诩毦禺愋缘鞍讏D譜的基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)具有快速、簡單、高通量、準確性高、穩(wěn)定性好等特點，可以滿足細菌耐藥性監(jiān)測中細菌鑒定的需求，而且MALDI-TOF鑒定微生物的方法已經(jīng)成為全球臨床微生物實驗室細菌分離株常規(guī)鑒定的參考方法[5]。MALDI-TOF技術(shù)基本原理為：將微生物樣品與基質(zhì)分別點加在鋼靶上，晾干后形成共結(jié)晶，發(fā)射激光，基質(zhì)吸收激光能量幫助樣品分子電離，經(jīng)過飛行時間檢測器進行信號檢測，生成質(zhì)譜圖，縱坐標為離子峰，橫坐標為離子質(zhì)荷比(m/z)[6]。通過采集2000～20000 kD區(qū)間的微生物蛋白指紋圖譜，掃描每個物種的特征峰值，與大型數(shù)據(jù)庫中標準圖譜進行匹配，能夠鑒定細菌種屬[7-8]。本研究通過選擇MALDI-TOF方法，快速有效地鑒定雞、牛和羊來源的大腸桿菌和腸球菌臨床分離菌株，開展細菌耐藥表型檢測，以期待為臨床細菌耐藥性監(jiān)測工作提供技術(shù)支撐和參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣品 分別從五家獸用抗菌藥使用減量化試點(兩家雞場來自寧夏某養(yǎng)殖場和湖南某養(yǎng)殖場，一家羊場來自浙江某養(yǎng)殖場，兩家牛場分別來自寧夏某養(yǎng)牛場和河南某養(yǎng)牛場)進行抽樣，每個養(yǎng)殖場15份樣品，總共75份樣品。標準菌株為大腸桿菌ATCC25922和糞腸球菌ATCC29212。

1.2 試劑與儀器 運送培養(yǎng)基、大腸桿菌顯色培養(yǎng)基、腸球菌顯色培養(yǎng)基、普通營養(yǎng)瓊脂(青島海博生物有限公司)；甲酸；乙腈；無水乙醇；CHCA基質(zhì)溶液；臺式冷凍離心機：德國Sigma公司；基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜儀：島津公司；VITEK-2全自動微生物鑒定儀、濁度儀、革蘭氏陰性鑒定卡(GN)和革蘭氏陽性鑒定卡(GP)：梅里埃公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集與細菌分離 采集不同養(yǎng)殖場動物(雞、牛和羊)糞便、設(shè)施表面和工人鼻腔拭子樣品，立即放入無菌運輸培養(yǎng)基中保存，低溫運送至實驗室。

分離純化：將保存在運送培養(yǎng)基中的樣品分別在大腸桿菌顯色培養(yǎng)基和腸球菌顯色培養(yǎng)基上劃線，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h。挑取大腸桿菌顯色培養(yǎng)基上的藍綠色單菌落(疑似大腸桿菌)和腸球菌顯色培養(yǎng)基上的紅色或紫色的單菌落(疑似腸球菌)再次在顯色培養(yǎng)基上劃線進行二次純化。

將質(zhì)控菌株大腸桿菌ATCC25922和腸球菌ATCC29212復(fù)蘇，在普通營養(yǎng)瓊脂上劃線，37 ℃培養(yǎng)18～24 h。

1.3.2 MALDI-TOF MS 鑒定 樣品前期處理：挑取純化后的疑似單菌落在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)。用無菌接種環(huán)挑取適量樣品于1.5 mL離心管中，加入300 μL純水和900 μL無水乙醇，混勻，12000 rpm/min，離心2 min，棄去上清；向沉淀中加入50 μL70%甲酸，混勻，再加入50 μL乙腈，混勻，12000 rpm/min，離心2 min，留上清。質(zhì)控菌株ATCC25922的處理同上。

點樣：先在干凈的鋼靶上點1 μL上清，放干后再點2 μL CHCA基質(zhì)溶液，晾干后送入上樣系統(tǒng)。

MALDI-TOF 鑒定：選擇儀器運行模式Linear_saramis，設(shè)置掃描范圍2000～20000，激光頻率20；激光能量66，采集譜圖數(shù)Profiles 100，shot 2，Blank 1500，PμLsed Extraction 8330；利用Auto quality自動獲得譜圖。設(shè)置好參數(shù)后開始采集質(zhì)控菌株ATCC25922的數(shù)據(jù)，進行校準。校準完成后開始進行樣品數(shù)據(jù)采集。

數(shù)據(jù)處理：將導(dǎo)出txt格式的數(shù)據(jù)拷貝到數(shù)據(jù)庫電腦的鑒定軟件中自動讀取數(shù)據(jù)并鑒定。鑒定結(jié)果給出科、屬、種三個水平。

1.3.3 VITEK 2 生化鑒定 挑取適量的分離純培養(yǎng)的菌株于3 mL的0.45%無菌鹽水中混勻，用VITEK 2 比濁儀配置相當(dāng)于0.5～0.63麥氏單位的菌懸液。將懸浮液管及GN、GP卡置于載卡臺上，連接菌液管和鑒定卡，放入儀器中，按照VITEK全自動生化鑒定系統(tǒng)操作流程進行樣品鑒定。

1.3.4 細菌耐藥表型檢測 采用微量肉湯稀釋法測定大腸桿菌和腸球菌對抗菌藥物的耐藥性，測定大腸桿菌對氨芐西林、阿莫西林/克拉維酸、慶大霉素、四環(huán)素、磺胺異噁唑、復(fù)方新諾明、頭孢他啶、氧氟沙星、美羅培南、黏菌素的耐藥表型，腸球菌對青霉素、紅霉素、萬古霉素、苯唑西林、多西環(huán)素、利奈唑胺的耐藥表型。參照美國臨床實驗室標準化委員會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)標準[9]進行結(jié)果判定。大腸桿菌和腸球菌分別用ATCC25922和ATCC29212進行質(zhì)控。

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌鑒定結(jié)果 針對湖南、寧夏、河南和浙江地區(qū)進行樣品采集的75份樣品(雞養(yǎng)殖場采集30份，牛養(yǎng)殖場30份，羊養(yǎng)殖場15份樣品)，將棉簽拭子樣本分別在大腸桿菌顯色平板和腸球菌顯色平板劃線過夜培養(yǎng)。大腸桿菌典型菌落為藍色，邊緣整齊，表面濕潤的圓形菌落，腸球菌典型菌落為紅色至紫色，邊緣整齊，表面濕潤的針尖樣菌落。針對上述疑似大腸桿菌或腸球菌進行MALDI-TOF MS鑒定，大腸桿菌分離率為41.33%(31/75)，腸球菌分離率為45.33%(34/75)(糞腸球菌14株，屎腸球菌18株、海氏腸球菌2株)(圖1和表1)。

圖1 樣品的MALDI-TOF MS譜圖Fig 1 MALDI-TOF MS spectrum of the samples

表1 不同動物來源的細菌分離情況Tab 1 Isolation of bacteria from different animal sources

VITEK生化鑒定結(jié)果中，31株被鑒定為大腸桿菌，34株被鑒定為腸球菌，結(jié)果與MALDI-TOF MS結(jié)果一致。

2.2 細菌耐藥性結(jié)果

2.2.1 大腸桿菌耐藥性檢測結(jié)果 藥敏試驗結(jié)果顯示(圖2)，三種動物來源分離獲得的大腸桿菌均對四環(huán)素高度耐藥(100%)；雞、牛和羊源大腸桿菌對氨芐西林(91.67%、27.27%、75%)、阿莫西林/克拉維酸(58%、0、37.5%)、磺胺異惡唑(83.33%、18.18%、75%)表現(xiàn)出不同程度耐藥性，而且雞源大腸桿菌的10種抗菌藥物中的5種藥物(阿莫西林/克拉維酸、慶大霉素、四環(huán)素、磺胺異惡唑、復(fù)方新諾明)的MIC50比?；蜓蛟吹拇竽c桿菌高。雞源、牛源和羊源大腸桿菌多重耐藥率分別為90.9%、36.36%和87.5%，雞和羊源大腸桿菌表現(xiàn)五重耐藥性(β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、四環(huán)素類、磺胺類抗、喹諾酮類)，牛源大腸桿菌表現(xiàn)四重耐藥性(β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、磺胺類抗、喹諾酮類)。由此可見，雞源大腸桿菌耐藥情況最為嚴重。

圖2 大腸桿菌的生化反應(yīng)結(jié)果Fig 2 The resμLt of the biochemical reaction of E. coli

圖3 腸球菌的生化反應(yīng)結(jié)果(a:糞腸球菌；b:屎腸球菌；c:海氏腸球菌)Fig 3 The resμLt of the biochemical reaction of Enterococcus

圖4 不同動物來源的大腸桿菌耐藥情況Fig 4 Resistance of E. coli from different animal sources

2.2.2 腸球菌耐藥性檢測結(jié)果 從藥敏試驗結(jié)果得出，雞源、牛源和羊源腸球菌對青霉素(3.45%、0、0)、紅霉素(55.17%、22.73%、28.57%)、多西環(huán)素(51.72%、4.55%、9.09%)、苯唑西林(62.07%、36.36%、9.09%)和利奈唑胺(27.59%、0、21.43%)表現(xiàn)出不同程度的耐藥性，雞源腸球菌對上述5種抗菌藥物的耐藥率普遍高于牛和羊源腸球菌的耐藥率。而且雞源腸球菌的6種藥物中的3種抗菌藥物(紅霉素、多西環(huán)素、利奈唑胺)的MIC50比牛或羊源的腸球菌高。三種動物來源均表現(xiàn)多重耐藥現(xiàn)象。其中，雞源腸球菌多重耐藥率為100%，對β-內(nèi)酰胺類、大環(huán)內(nèi)酯和四環(huán)素三類抗菌藥物耐藥，牛源和羊源腸球菌多重耐藥率分別為77.78%和66.67%，均對大環(huán)內(nèi)酯、四環(huán)素和β-內(nèi)酰胺類三類抗菌藥物耐藥。藥敏試驗結(jié)果顯示雞源腸球菌耐藥性最為嚴重。

圖5 不同動物來源的腸球菌耐藥情況Fig 5 Resistance of Enterococcus from different animal sources

3 討 論

本研究采用MALDI-TOF MS鑒定細菌的方法，減少了不同細菌不同的檢測程序和步驟，高效地實現(xiàn)了對不同動物源的大腸桿菌和腸球菌的臨床鑒定。目前，MALDI-TOF MS作為快速鑒定的熱點應(yīng)用技術(shù)被廣泛采納應(yīng)用于國內(nèi)外臨床微生物臨床檢測研究。國家標準委發(fā)布了《GB/T 33682-2017基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜鑒別微生物方法通則》，美國臨床和實驗室標準協(xié)會發(fā)布《Methods for the Identification of CμLtured Microorganisms Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry》，表明MALDI-TOF MS已經(jīng)成為微生物菌種鑒定的標準方法。利用已知菌種建立數(shù)據(jù)庫，通過質(zhì)譜檢測獲得蛋白指紋圖譜，與數(shù)據(jù)庫中的參考圖譜對比后得到鑒定結(jié)果，這種方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用到臨床上微生物的物種水平鑒定。Rychert等[10]對1146份革蘭氏陽性菌的樣品進行處理，經(jīng)MALDI-TOF鑒定出1063份樣品，種水平準確率為92.8%，屬水平準確率達95.5%；Faron等[11]采集2263份革蘭氏陰性菌進行MALDI-TOF鑒定，結(jié)果表明種屬水平分別為98.2%、99.8%。這說明MALDI-TOF MS在革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌中都具有很高的準確性和可信性。Koziel等[12]結(jié)合MALDI-TOF和16S rRNA鑒定出獼猴糞便中存在CIT 045(T)解脲彎曲桿菌。MALDI-TOF MS 也可以作為溯源分析手段，Jadhav等[13]將MALDI-TOF MS作為檢測食品和食品加工環(huán)境中的單核細胞增生性李斯特菌的鑒定和溯源手段，溯源結(jié)果與金標準脈沖電場技術(shù)具有良好的一致性。除此之外，MALDI-TOF MS也可以直接被應(yīng)用于臨床耐藥菌株相關(guān)的特征峰鑒定，從而實現(xiàn)對耐藥菌株的直接檢測。Wang等[14]利用耐藥相關(guān)特征峰值的不同來檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，通過直接尋找MRSA與MSSA對比的特征峰(m/z891、1140、1165、1229、2127)，確定其為MRSA。Lau等[15]利用MALDI-TOF MS分析耐藥性相關(guān)質(zhì)粒(攜帶碳青霉烯酶基因blaKPC的pKpQIL質(zhì)粒)，結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)鑒定表征了與pKpQIL質(zhì)粒的基因產(chǎn)物相對應(yīng)的m/z11109 Da峰，實現(xiàn)耐藥菌的快速鑒定。

值得注意的是，本研究中雞源大腸桿菌和腸球菌對多數(shù)藥物耐藥程度明顯高于牛和羊場分離的大腸桿菌和腸球菌相應(yīng)藥物的耐藥程度，提示不同動物來源的細菌對抗菌藥物的耐藥性有所不同。其他相關(guān)文獻報道中也有類似的實驗現(xiàn)象。唐標等[16]對雞、鴨、豬源大腸桿菌耐藥性調(diào)查結(jié)果顯示，雞源大腸桿菌的耐藥率高于鴨和豬源；Ibekwe等[17]對不同動物源產(chǎn)ESBL的大腸桿菌調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)產(chǎn)ESBL的大腸桿菌在不同動物源中分布廣泛，但豬和奶牛糞便中檢測到的ESBL菌數(shù)量明顯高于其他動物；王熙楚等[18]對不同動物來源的腸球菌進行耐藥性分析，研究表明雞源腸球菌耐藥性較其他動物來源更為嚴重。其中，雞源大腸桿菌對四環(huán)素和氨芐西林高耐藥率現(xiàn)象與我國不同區(qū)域雞源大腸桿菌耐藥表型結(jié)果相一致[19]。同時也相似于韓國地區(qū)大腸桿菌對四環(huán)素和氨芐西林的高耐藥性率[20]。雞源腸球菌對多西環(huán)素和紅霉素的高耐藥率現(xiàn)象與我國其他地區(qū)腸球菌的高耐藥率也相一致[21-22]。

綜上所述，為了有效地控制細菌耐藥性，持續(xù)地針對不同地區(qū)不同動物來源的大批量細菌鑒定工作將是常態(tài)化技術(shù)工作，高效的細菌鑒定技術(shù)MALDI-TOF MS可以提高監(jiān)測效率，值得在動物源細菌耐藥性監(jiān)測領(lǐng)域推廣應(yīng)用。與此同時，應(yīng)該密切關(guān)注不同動物源細菌耐藥性不同的現(xiàn)象，利用高效檢測技術(shù)，探索不同動物源細菌耐藥性不同的問題原因。