張 娜，陳 靜, 張培訓(xùn),張秋娜,楊彥超, 辛 雪

(1.保定冀中藥業(yè)有限公司，河北保定 071000； 2.河北省中獸藥技術(shù)創(chuàng)新中心，河北保定 071500；3.華譜科儀(大連)科技有限公司，遼寧大連 116000)

隨著農(nóng)業(yè)農(nóng)村部減抗政策的實(shí)施，中獸藥制劑因其低毒副作用、不產(chǎn)生耐藥性更為廣大養(yǎng)殖戶所青睞，但同時(shí)伴隨著國(guó)家監(jiān)管力度的增加[1-5]，在市場(chǎng)抽檢過(guò)程中檢出多種非法添加、殘留藥物，涉及磺胺類(lèi)、喹諾酮類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)、酰胺醇類(lèi)、呋喃類(lèi)等，使得養(yǎng)殖集團(tuán)不得不從源頭加強(qiáng)食品動(dòng)物的用藥安全把控，要求獸藥生產(chǎn)企業(yè)按照動(dòng)物源性產(chǎn)品中禁限用獸藥的檢測(cè)限來(lái)提供產(chǎn)品的檢測(cè)結(jié)果，這對(duì)獸藥生產(chǎn)企業(yè)來(lái)說(shuō)是嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。

但是從目前已頒布的多項(xiàng)中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告及國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)來(lái)看，對(duì)中獸藥制劑中禁限用獸藥的檢測(cè)方法多為HPLC-PDA法，檢測(cè)限難以滿足養(yǎng)殖集團(tuán)的用藥需求，同時(shí)我們也發(fā)現(xiàn)公告及文獻(xiàn)報(bào)道[6-10]中涉及的獸藥制劑多集中于中獸藥注射液、固體散劑、口服液劑型，前處理方法多為提取后直接稀釋進(jìn)樣，這直接導(dǎo)致了檢測(cè)的靈敏度降低，同時(shí)易污染設(shè)備。為降低中獸藥中復(fù)雜的基質(zhì)干擾，提高檢測(cè)限，宋軍、馬東杰等[11-12]采用PRIME HLB對(duì)基質(zhì)進(jìn)行凈化，檢測(cè)中獸藥中硝基咪唑類(lèi)和硝基呋喃類(lèi)藥物，使檢出限和定量限低至10～25 μg/kg，但對(duì)于養(yǎng)殖集團(tuán)關(guān)切的多種禁限用獸藥的檢測(cè)未有提及。

因此，建立一種快速、簡(jiǎn)便、靈敏、可靠、可同時(shí)檢測(cè)中獸藥中多類(lèi)非法添加或藥物殘留的禁限用獸藥的檢測(cè)方法十分必要。本實(shí)驗(yàn)室首次將親水親油平衡材料(HLB SPE)固相萃取柱用于麻杏石甘口服液的前處理，經(jīng)考察17種禁限用獸藥的回收率均符合要求。其中喹乙醇的檢出限為10 ng/mL、定量限為25 μg/mL，剩余16種藥物的檢出限均低至5 ng/mL、定量限為10 ng/mL，極大保障了中獸藥產(chǎn)品用藥安全，同時(shí)也為中獸藥制劑中常見(jiàn)非特定添加藥物及殘留的快速判定提供了可靠的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器 UPLC Acquity -XEVO TQD 超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀， Masslynx色譜工作站(美國(guó)Waters 公司)、BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm×1.7 μm)、CPA225D電子分析天平(德國(guó)Sartorius公司)。

1.2 試藥與試劑 磺胺嘧啶對(duì)照品(批號(hào)：H0361504，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，純度99.5%)，磺胺甲基嘧啶對(duì)照品(批號(hào)：G982705，Dr.Ehrenstorfer，純度99.1%)，磺胺二甲嘧啶對(duì)照品(批號(hào)：H0371406，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,純度99.2%)，磺胺間甲氧嘧啶對(duì)照品(批號(hào)：C0031610，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，純度99.5%)，磺胺甲噁唑?qū)φ掌?批號(hào)：H0261106，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，純度99.8%)，磺胺二甲氧嘧啶對(duì)照品(批號(hào)：C0061807，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，純度99.6%)，磺胺喹噁啉對(duì)照品(批號(hào)：H0251407，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，純度99.6%)，氧氟沙星對(duì)照品(批號(hào)：H0091210，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，純度99.5%)，環(huán)丙沙星對(duì)照品(批號(hào)：130451-201904，中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度83.1%)，恩諾沙星對(duì)照品(批號(hào)：H0081505，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，純度99.5%)，多西環(huán)素對(duì)照品(批號(hào)：K0131507，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，純度85.2%)，氟苯尼考對(duì)照品(批號(hào)：K0302010，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，純度99.6%)，喹乙醇對(duì)照品(批號(hào)：C1572400，Dr.Ehrenstorfer，純度97.8%)，甲氧芐啶對(duì)照品(批號(hào)：100031-201606，中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度99.8%)，金剛烷胺對(duì)照品(批號(hào)：G5410125，ANPEL，純度97.5%)，氯霉素對(duì)照品(批號(hào)：130555-201704，中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度99.8%)，地塞米松對(duì)照品(批號(hào)：100129-201508，中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度99.8%)，親水親油平衡材料(HLB SPE)固相萃取柱(200 mg，6 mL，華譜科儀(大連)科技有限公司)

供試品：麻杏石甘口服液(保定冀中藥業(yè)有限公司，規(guī)格：100 mL/瓶，批號(hào)：202109029、202108028、202108027)，乙腈(Merck公司，色譜純)，甲酸(Fisher Scientific，色譜純，批號(hào)：106055A)。

1.3 液相色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈(A)-0.1%甲酸(B)梯度洗脫流速：0.2 mL/min，柱溫：30 ℃,進(jìn)樣量5 μL，梯度洗脫程序見(jiàn)表1，該液相色譜條件適用于1組的13種藥物。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Program of gradient elution

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈(A)-0.1%甲酸(B)梯度洗脫流速：0.2 mL/min，柱溫：30 ℃,進(jìn)樣量5 μL，梯度洗脫程序見(jiàn)表2，該液相色譜條件適用于2組的4種藥物。

表2 梯度洗脫程序Tab 2 Program of gradient elution

1.4 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源，正離子掃描和負(fù)離子掃描；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式；正離子模式毛細(xì)管電壓3.0 kV，負(fù)離子模式毛細(xì)管電壓2.0 kV；脫溶劑氣溫度500 ℃，脫溶劑氣流速1000L/Hr；各化合物質(zhì)譜采集參數(shù)見(jiàn)表3。

表3 17種化合物質(zhì)譜參數(shù)Tab 3 Retention time and mainmass spectrametry parameters of 17 compounds

1.5 樣品制備

1.5.1 陰性樣品制備 麻杏石甘口服液，實(shí)驗(yàn)室自制。

1.5.2 單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的制備 分別準(zhǔn)確稱取適量的各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)共計(jì)17種化合物，分別用甲醇溶解并定容，配制成 500 μg/mL 的單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于-20 ℃ 以 下避光冷凍保存。

1.5.3 混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的制備 分別精密量取50 μL 17種化合物單標(biāo)儲(chǔ)備液于10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度， 配制成 2.5 μg/mL 的 17種化合物混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于-20 ℃ 以 下避光冷凍保存。

1.5.4 樣品溶液的制備 精密量取2 mL麻杏石甘口服液于50 mL離心管中，加10 mL甲醇，渦旋2 min，超聲提取5 min，5000 r/min離心5 min，取全部上清液通過(guò)HLB小柱，收集凈化液，氮吹(45 ℃)至近干，加甲醇：0.1%甲酸=10:90定容至2 mL，搖勻，過(guò)濾，即得。

1.5.5 空白基質(zhì)溶液的制備 精密量取陰性樣品3 份，按照 1.5.4項(xiàng)下方法處理后即得空白基質(zhì)溶液。

1.5.6 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的制備 精密量取混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液50 μL置10 mL 容量瓶中，加空白基質(zhì)溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，即得 2.5 μg/mL 的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。

1.5.7 陽(yáng)性添加樣品溶液的制備 精密量取混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量加入到陰性空白麻杏石甘口服液中，混勻，制成每1L分別添加10、25、50 μg(喹乙醇添加25、50、100 μg)的陽(yáng)性添加樣品，每個(gè)添加量制備3份平行樣，按1.5.4所述方法制備陽(yáng)性添加樣品，進(jìn)行測(cè)定，每份樣品至少進(jìn)樣2次，取平均值。

1.5.8 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 準(zhǔn)確吸取1 mL基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(2.5 μg/mL)，至10 mL量瓶中，用空白基質(zhì)溶液稀釋至刻度，搖勻，得0.25 μg/mL的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精密吸取該基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用空白基質(zhì)溶液稀釋制成5、10、25、50、100、120 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)系列工作液。

1.5.9 檢出限和定量限 在空白基質(zhì)溶液中添加適量的17種化合物的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，按照1.5.4所述方法制備樣品，照1.4所述儀器條件進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)行檢出限和定量限的測(cè)定。

3 結(jié)果與分析

3.1 線性范圍 按 1.5.8方法配制的 17種化合物基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線在選定的儀器條件下測(cè)定。17種化合物基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液總離子流圖見(jiàn)圖1～2，各化合物分離度良好，響應(yīng)靈敏。以各化合物定量離子色譜峰面積 A 為縱坐標(biāo)，各化合物質(zhì)量濃度(ng/mL)為橫坐標(biāo)，繪制線性回歸方程。結(jié)果表明：17種化合物在 10～100 ng/mL(喹乙醇25～120 ng/mL)濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r均大于 0.99，17種化合物的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表4。

圖1 第1組13種化合物基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液總離子流圖Fig1 Total ion flow chromatograms of 13 compounds matrix standard solution in the first group

圖2 第2組4種化合物基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液總離子流圖Fig2 Total ion flow chromatograms of 4 compounds matrix standard solution in the second group

表4 17種化合物線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)Tab 4 Mainmass spectrametry parameters of 17 compounds

3.2 精密度考察 精密吸取基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液 (25 ng/mL)5 μL，連續(xù)進(jìn)樣 6次。以峰面積計(jì)算，得出17種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的RSD為1.9%，表明儀器的精密度良好，符合要求。

3.3 檢出限和定量限 測(cè)定結(jié)果表明：在相應(yīng)的保留時(shí)間，空白樣品對(duì) 17 種目標(biāo)化合物無(wú)干擾，空白樣品溶液總離子流圖見(jiàn)圖3～圖4。依據(jù)特征離子質(zhì)量色譜峰信噪比S/N≥3的濃度為方法檢出限，其中僅喹乙醇的檢出限為10 ng/mL，剩余16種藥物的檢出限均為5 ng/mL，特征離子質(zhì)量色譜峰信噪比S/N≥10的濃度為方法定量限，其中僅喹乙醇的定量限為25 ng/mL，剩余16種藥物的定量限為10 ng/mL。

圖3 第1組空白樣品溶液總離子流圖Fig3 Total ion flow chromatograms of blank samples in the first group

圖4 第2組空白樣品溶液總離子流圖Fig4 Total ion flow chromatograms of blank samples in the second group

3.4 準(zhǔn)確度 分別制備10、25、50 ng/mL三個(gè)添加濃度(喹乙醇添加濃度為25、50、100 ng/mL)，經(jīng)測(cè)定，平均回收率在73.87%～116.43%之間，RSD為1.25～8.44%(表5)。

表5 回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab 5 Results of recoveries

續(xù)表5

4 討論與結(jié)論

4.1 篩查物質(zhì)種類(lèi)確定 據(jù)文獻(xiàn)[13-14]報(bào)道，市售中獸藥注射液、口服液、散劑中非法添加藥物有氯霉素(酰胺醇類(lèi)藥物)、氟喹諾酮類(lèi)藥物、抗病毒藥物(金剛烷胺)、喹諾酮類(lèi)藥物，在與各養(yǎng)殖集團(tuán)合作過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖企業(yè)對(duì)上述品類(lèi)中17種藥物的關(guān)注度較高，因此，本文中就17種藥物的檢測(cè)開(kāi)展研究。

4.2 凈化條件的選擇 在前期的試驗(yàn)過(guò)程中，我們?cè)鴧⒄辙r(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告289號(hào)采用稀釋法(甲醇、乙腈)進(jìn)行供試品前處理的制備，具體操作方法為取供試品1 mL，加甲醇4 mL，渦旋混勻后，離心，取上清1 mL，加0.1%甲酸溶液1 mL，混勻，過(guò)0.22 μm濾膜，上機(jī)檢測(cè)。但是長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)行后供試品溶液中未去除的復(fù)雜基質(zhì)會(huì)累積在錐孔處，有大量的黑褐色斑塊出現(xiàn)，需要經(jīng)常性拆卸錐孔進(jìn)行清理維護(hù)，采用與本文相同的流動(dòng)相體系，喹乙醇的檢出限為50 ng/mL，定量限為100 ng/mL，剩余16種藥物的檢出限為25 ng/mL，定量限為50 ng/mL，難以滿足養(yǎng)殖集團(tuán)的要求。在此基礎(chǔ)上嘗試采用甲醇提取繼而采用透過(guò)法通過(guò)親水親油平衡材料(HLB SPE)固相萃取柱凈化，可使供試品溶液的顏色由紅棕色改為淺黃色，大大降低基質(zhì)干擾程度，滿足檢測(cè)需求。

4.3 改進(jìn)計(jì)劃 經(jīng)過(guò)比對(duì)，對(duì)畜禽養(yǎng)殖過(guò)程中常用到的雙黃連口服液、清瘟解毒口服液、清解合劑和板青顆粒均進(jìn)行了相關(guān)的研究，對(duì)于基質(zhì)的干擾排除分別采用了通過(guò)親水親油平衡材料(HLB SPE)固相萃取柱、QuEChers凈化管、GCB固相萃取小柱等前處理方法，不同產(chǎn)品中物質(zhì)的響應(yīng)受到不同程度的干擾，后期還需進(jìn)行詳細(xì)的研究，以期能夠建立針對(duì)各產(chǎn)品的快速、高效、準(zhǔn)確的方法便于進(jìn)行安全性的質(zhì)量控制。

4.4 結(jié)論 研究建立了一種系統(tǒng)篩查中獸藥口服液制劑中17種化合物的檢測(cè)方法，發(fā)揮了液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜準(zhǔn)確靈敏的優(yōu)勢(shì)，首次建立了中獸藥液體制劑麻杏石甘口服液中多種非特定非法添加/殘留物質(zhì)的檢測(cè)方法，有效加強(qiáng)了獸藥生產(chǎn)企業(yè)對(duì)于產(chǎn)品質(zhì)量的控制，建立了中獸藥制劑中動(dòng)物源性食品禁限用獸藥的檢測(cè)、判定的科學(xué)依據(jù)，增強(qiáng)了動(dòng)物源性食品的安全屏障。該方法操作簡(jiǎn)單，凈化效果好，準(zhǔn)確度、靈敏度高，檢測(cè)限低，適用于麻杏石甘口服液的安全性檢測(cè)。