蹇艾利，申元英，姜石松，2△

(1.云南大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)及免疫學(xué)教研室，云南 大理 671000；2.英國牛津大學(xué)腫瘤系，英國 牛津 OX3 7DQ)

腫瘤壞死因子(TNF)是一種多功能細(xì)胞因子，既能促進(jìn)細(xì)胞增殖，引起炎性反應(yīng)；也能殺傷腫瘤細(xì)胞[1-2]。TNF由多種細(xì)胞分泌，但主要是巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞，其中單核-巨噬細(xì)胞分泌的為TNF-α，也是通常說的TNF；活化T淋巴細(xì)胞分泌的淋巴毒素也稱為TNF-β。TNF-α是炎性反應(yīng)中水平最先升高的細(xì)胞因子，因被發(fā)現(xiàn)其具有誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性癌癥快速出血性壞死的能力而命名，對機(jī)體生理和病理均有著深刻而多樣的影響[3]。TNF-α作為巨噬細(xì)胞分泌的多功能細(xì)胞因子，在本身具有系統(tǒng)性炎性反應(yīng)作用的同時(shí)，還可作為調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞誘導(dǎo)其他炎性細(xì)胞因子的表達(dá)[4]。在發(fā)現(xiàn)TNF-α之初，人們以為發(fā)現(xiàn)了對抗腫瘤的重磅治療手段，然而后來的研究卻發(fā)現(xiàn)TNF-α不僅不能用于體內(nèi)腫瘤治療，反而會引起敗血癥休克及其他許多急、慢性炎癥。TNF-α作為TNF超家族中體現(xiàn)生物學(xué)活性的主要成員，參與了多種炎癥性疾病[5-6]。關(guān)于TNF-α的前期研究表明，TNF-α與不同TNF受體結(jié)合后會發(fā)揮不同的生物學(xué)效應(yīng)[7]。常見的TNF-α抑制劑包括英夫利昔單抗、阿達(dá)木單抗、依那西普和戈利木單抗，通過與TNF-α的高親和力阻斷其與受體的相互作用，進(jìn)而達(dá)到抑制炎性反應(yīng)的作用[8]。然而，目前對TNF-α的研究大部分聚焦于其作用與信號通路，鮮有相關(guān)生物信息分析，并且適當(dāng)?shù)腡NF-α與受體相互作用有助于體內(nèi)炎癥介質(zhì)的清除，因此，根據(jù)對人源TNF-α的生物信息學(xué)分析找到新的藥物設(shè)計(jì)靶點(diǎn)至關(guān)重要。

1 材料與方法

1.1材料 在Uniprot數(shù)據(jù)庫檢索并下載人源TNF-α的蛋白質(zhì)序列(登錄號為P01375)獲取人源TNF-α蛋白氨基酸序列。

1.2方法

1.2.1人源TNF-α蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析 通過Expasy在線預(yù)測網(wǎng)站(https：//web.expasy.org/protparam/)預(yù)測人源TNF-α蛋白理化性質(zhì)。

1.2.2預(yù)測信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)及亞細(xì)胞位置 利用在線數(shù)據(jù)庫TMHMM Server V2.0(https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0)分析人源TNF-α跨膜結(jié)構(gòu)域；利用在線數(shù)據(jù)庫SignalP-5.0(https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0)預(yù)測該蛋白的信號肽序列；利用在線數(shù)據(jù)庫Cell-Ploc(http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-Ploc-2/)預(yù)測人源TNF-α蛋白的亞細(xì)胞定位。

1.2.3人源TNF-α蛋白空間結(jié)構(gòu)分析 利用PRABI數(shù)據(jù)庫中的SOPMA(https：//npsaprabi.ibcp.fr/cgibin，secpred sopma.pl)進(jìn)行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測；利用SWISS-MODEL(https：//swissmodel.expasy.org/interactive#sequence)在線預(yù)測網(wǎng)站對蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。

1.2.4疏水性預(yù)測 利用在線數(shù)據(jù)庫Protscale的Hopp&woods算法預(yù)測人源TNF-α蛋白的疏水性。

1.2.5人源TNF-α蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測 登錄“http：//www.cbs.dtu.dk/services/netrhos/”網(wǎng)站對蛋白磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測。

1.2.6人源TNF-α蛋白相互作用蛋白分析 采用String在線軟件分析蛋白的相互作用。

1.2.7人源TNF-α蛋白抗原表位的預(yù)測 利用IEDB數(shù)據(jù)庫預(yù)測人源TNF-α的優(yōu)勢B細(xì)胞表位。

2 結(jié) 果

2.1人源TNF-α蛋白理化性質(zhì) 人源TNF-α相對分子質(zhì)量為26×103，理論等電點(diǎn)為6.44，分子式為C1152H1825N313O337S6。共編碼233個(gè)氨基酸，其中丙氨酸、亮氨酸、絲氨酸含量較高，分別占8.15%、12.88%、8.58%。見表1。帶負(fù)電荷的氨基酸(天冬氨酸+谷氨酸)殘基數(shù)目為23個(gè)，帶正電荷的氨基酸(精氨酸+賴氨酸+組氨酸)殘基數(shù)目為26個(gè)，疏水性氨基酸殘基數(shù)目為123個(gè)。不穩(wěn)定系數(shù)為40.75(為不穩(wěn)定蛋白)。脂肪系數(shù)為98.87，親水性平均系數(shù)為-0.047(為親水性蛋白)。預(yù)測半衰期在哺乳動(dòng)物網(wǎng)織紅細(xì)胞體外約為30 h，在酵母內(nèi)大于20 h，在大腸桿菌內(nèi)大于10 h。

表1 人源TNF-α蛋白氨基酸組成(n=233)

2.2信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)域及亞細(xì)胞定位 該蛋白信號肽結(jié)果顯示可能性為0.000 7，可推斷不是分泌蛋白。預(yù)測人源TNF-α蛋白擁有一個(gè)跨膜區(qū)，推測位于第35～57個(gè)氨基酸區(qū)間，位于N端。第1～34個(gè)氨基酸位于膜內(nèi)，第58～233個(gè)氨基酸位于膜外。TNF屬于Ⅱ類跨膜蛋白，C端位于細(xì)胞外，并且含有較多疏水性氨基酸，主要構(gòu)成TNF活性三聚體的β-片層的中間鏈，是參與維持TNF立體結(jié)構(gòu)的重要物質(zhì)；而N端位于細(xì)胞內(nèi)含有較多親水性氨基酸，是TNF與TNF受體(TNFR)相互作用的部位。TNF具有兩種形式，一種是相對分子質(zhì)量為26×103的膜型TNF，在細(xì)胞膜上與細(xì)胞共同發(fā)揮作用刺激免疫細(xì)胞；另一種是相對分子質(zhì)量為17×103的可溶型TNF，是通過TNF轉(zhuǎn)換酶對膜型TNF進(jìn)行酶促裂解而形成的，在血液中結(jié)合TNFR1發(fā)揮作用，與本課題組前期研究結(jié)果相符[9]。預(yù)測該蛋白亞細(xì)胞定位在細(xì)胞膜上。見圖1。

2.3人源TNF-α蛋白空間結(jié)構(gòu) 人源TNF-α氨基酸序列中α-螺旋結(jié)構(gòu)有73個(gè)氨基酸，占二級結(jié)構(gòu)總數(shù)的31.33%；β-折疊結(jié)構(gòu)有60個(gè)氨基酸，占二級結(jié)構(gòu)總數(shù)的25.75%；β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)有17個(gè)氨基酸，占二級結(jié)構(gòu)總數(shù)的7.30%；無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)有83個(gè)氨基酸，占二級結(jié)構(gòu)總數(shù)的35.62%。運(yùn)用SWISS-MODEL在線建模分析人源TNF-α三級結(jié)構(gòu)。該模型全局模型質(zhì)量估計(jì)評分為0.61分，所得模型質(zhì)量良好，結(jié)構(gòu)分析為同源性三聚體蛋白。見圖2。

2.4人源TNF-α蛋白親/疏水性、磷酸化位點(diǎn)及相互作用蛋白網(wǎng)格 人源TNF-α蛋白含有多個(gè)親水性區(qū)域和疏水性區(qū)域，其分布聚集不明顯。人源TNF-α蛋白有15個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)，6個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)，3個(gè)酪氨酸(磷酸化位點(diǎn))。其中第151～200個(gè)序列中磷酸化位點(diǎn)最多，推測此處可能為重要功能區(qū)域，與本課題組前期研究證明該區(qū)域?qū)儆诠δ芷蜗喾鸞9]。與人源TNF-α蛋白有相互作用的蛋白分別為TNFAIP3、RIPK1、BIRC2、TRAF2、FADD、TRADD、IKBKG、TNFRSF1A、TNFRSE1B、IL-10等，與人源TNF-α相互作用的具體機(jī)制具有重要意義。見圖3。

2.5人源TNF-α蛋白優(yōu)勢抗原表位 共有7個(gè)優(yōu)勢表位，分別位于第7～27、55～87、97～114、142～150、160～166、175～190、213～223區(qū)間。見圖4、表2。7個(gè)優(yōu)勢表位可為后期設(shè)計(jì)針對人源TNF-α藥物、多肽提供靶點(diǎn)。

表2 人源TNF-α 蛋白刺激B細(xì)胞優(yōu)勢表位氨基酸序列

3 討 論

對TNF-α的研究由來已久，但主要集中于TNF-α的產(chǎn)生、作用及相關(guān)信號通路方面，少有關(guān)于TNF-α生物信息學(xué)分析。作者前期研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α之所以能誘導(dǎo)多種生物學(xué)功能主要是來自于3個(gè)重要的細(xì)胞內(nèi)事件：(1)刺激核因子κB (NF-κB)活化；(2)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；(3)誘導(dǎo)細(xì)胞壞死[9]。

3.1三聚體TNF-α的促炎性作用 TNF-α是炎癥過程中最早出現(xiàn)的炎癥介質(zhì)，當(dāng)TNF-α結(jié)合TNFR1后活化下游一系列蛋白激酶，降解NF-κB抑制因子激酶，激活NF-κB信號通路，產(chǎn)生更多的細(xì)胞因子，促進(jìn)細(xì)胞增殖；經(jīng)NF-κB活化誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白，如促炎性細(xì)胞因子TNF-α又再次活化NF-κB，這樣就產(chǎn)生了一種擴(kuò)大炎性反應(yīng)的惡性循環(huán)。當(dāng)發(fā)生急性炎癥時(shí)，TNF-α趨化至局部炎性病灶，并且刺激其他炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，加速對病原體的清除；當(dāng)TNF-α等炎癥介質(zhì)擴(kuò)散到全身時(shí)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)形成正反饋，多種免疫細(xì)胞被激活，不斷產(chǎn)生更多的促炎性細(xì)胞因子，形成“瀑布效應(yīng)”，易造成全身多處器官衰竭而導(dǎo)致死亡。

3.2TNF-α衍生肽P16、P1516的促壞死作用 此前本課題組已證實(shí)一些TNF-α衍生的保守肽段可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和(或)壞死，并且不依賴于與TNFR結(jié)合的直接殺傷模式。TNF-α衍生肽P16、P1516通過破壞細(xì)胞膜完整性而引起壞死，其中P16可直接殺死人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞、原發(fā)性肝癌細(xì)胞和腎癌細(xì)胞，P1516因其具有獨(dú)特的二級結(jié)構(gòu)可通過誘導(dǎo)血管和淋巴管損傷抑制腫瘤在體內(nèi)的生長和轉(zhuǎn)移，從而提高存活率[10]。這些壞死誘導(dǎo)肽作為TNF-α的降解產(chǎn)物，其殺傷癌細(xì)胞和抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的能力可能會成為癌癥治療的新靶點(diǎn)。

3.3TNF-α衍生肽P1213的促凋亡作用 有研究表明，只有當(dāng)NF-κB信號通路被抑制時(shí)TNF-α的促凋亡/壞死作用通路才會被激活[11]。如NF-κB沒有被激活，TNF-α?xí)碳ぐ屑?xì)胞在細(xì)胞質(zhì)中形成復(fù)合物Ⅱ，與復(fù)合物Ⅰ比較，復(fù)合物Ⅱ缺少了TNFR1和細(xì)胞凋亡抑制因子-1，但增加了FADD、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-8(caspase-8)和caspase-10，其中caspase-8、caspase-10能活化效應(yīng)物caspase-3、caspase-6、caspase-7，并使之穿透細(xì)胞膜，在caspase激活的脫氧核糖核酸酶作用下切碎細(xì)胞核，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。作者發(fā)現(xiàn)，TNF-α衍生肽P1213可能通過能量依賴途徑進(jìn)入細(xì)胞，直接與TRADD結(jié)合，隨后與復(fù)合物Ⅱ作用，激活caspase-3，最后引起凋亡。這一發(fā)現(xiàn)為開發(fā)以這些衍生肽作為潛在的藥物靶點(diǎn)或治療用劑奠定了基礎(chǔ)。

因人們認(rèn)識到利用重組TNF-α治療癌癥時(shí)的治療指數(shù)非常小，甚至可誘導(dǎo)類似于內(nèi)毒素休克的體征和癥狀的細(xì)胞因子風(fēng)暴，所以，不能將大量的TNF-α用于抗癌治療中。此外有大量研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤微環(huán)境中TNF-α是引起癌癥相關(guān)炎癥的主要介質(zhì)[3，12-14]。在癌癥領(lǐng)域以外，TNF-α被認(rèn)為是炎癥的主要調(diào)節(jié)因子和細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的重要角色，無論是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長還是抵抗腫瘤細(xì)胞生長，TNF-α均是一個(gè)重要的檢測指標(biāo)[3]。TNF-α是炎性反應(yīng)過程中出現(xiàn)最早、最重要的炎癥介質(zhì)，能激活中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，使血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加，調(diào)節(jié)其他組織代謝活性并促使其他細(xì)胞因子的合成和釋放。對TNF-α的作用如不加以調(diào)節(jié)會引起慢性炎癥和全身性消耗，當(dāng)機(jī)體處于急性炎癥反應(yīng)狀態(tài)時(shí)，大量產(chǎn)生的TNF-α?xí)M(jìn)入全身循環(huán)會引起敗血性休克[15]。所以，對是否在正確的時(shí)候、正確的環(huán)境下產(chǎn)生適量的TNF-α是至關(guān)重要的，將TNF-α的產(chǎn)生限制于某一特定局部組織可能是控制其有益功能的機(jī)制之一[16]。由于蛋白質(zhì)在進(jìn)化過程中其保守的序列通常具有功能重要性，有研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α的某些氨基酸序列可能在不同物種中保持不變，并且不同的氨基酸序列發(fā)揮不同的功能[9]。有研究證實(shí)，當(dāng)TNF-α以三聚體形式存在時(shí)可激活NF-κB促進(jìn)細(xì)胞增殖，裂解為線性多肽時(shí)單獨(dú)肽P12和結(jié)合肽P1213可發(fā)揮誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的功能；單獨(dú)肽P15和結(jié)合肽P1516可發(fā)揮誘導(dǎo)細(xì)胞壞死的功能，并且這些肽段并沒有通過TNFR1促進(jìn)細(xì)胞死亡，而是直接破壞細(xì)胞膜。利用這些保守肽段的細(xì)胞毒性作用可能為癌癥治療方法提供新靶點(diǎn)，并且加強(qiáng)對體內(nèi)TNF-α抗體的研究可能會為由TNF-α升高引起的細(xì)胞因子風(fēng)暴提供治療策略。