姜志煒，韓新才*，祝 宏，劉 慧，史凱麗，李睿媛，馬 峻

1.武漢工程大學(xué)環(huán)境生態(tài)與生物工程學(xué)院，湖北 武漢 430205；

2.武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院，湖北 武漢 430205；

3.武漢市金銀潭醫(yī)院，湖北 武漢 430023

磷霉素（fosfomycin，通常指左旋磷霉素）是一種在臨床上常用的重要廣譜抗生素［1］，它具有獨(dú)特的殺菌作用，能抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成［2］，進(jìn)而達(dá)到殺死細(xì)菌的目的，且不易產(chǎn)生耐藥性，臨床上具有廣泛的應(yīng)用［3］。由于磷霉素對(duì)細(xì)胞壁合成的破壞，可以使其他藥物進(jìn)入到細(xì)菌體內(nèi)，進(jìn)而產(chǎn)生協(xié)同作用［4］，且磷霉素具有良好的口服生物利用度，低毒、安全，具有較好的承受性［5-6］。殼寡糖（chitosan oligosaccharide）主要來(lái)源于甲殼素［7-8］，是公認(rèn)的低分子量水溶性殼聚糖，其生物活性高于殼聚糖，具備帶正電荷、呈堿性、易溶于水［9］等特點(diǎn)，能抗菌、抗腫瘤［10］等，具有優(yōu)越的生物活性［11］。它的化學(xué)結(jié)構(gòu)與磷霉素呈現(xiàn)互補(bǔ)特征，二者的相互結(jié)合，在抵抗感染方面能夠具有一定的協(xié)同效應(yīng)。通過(guò)在磷霉素的合成工藝上進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)而制備出新型磷霉素-殼寡糖鹽（fosfomycin chitosan oligosaccharide salt，F(xiàn)COS），可以為磷霉素家族增添新的成員。磷霉素殼寡糖鹽于磷霉素類抗菌藥而言，具有重要的研究意義，應(yīng)對(duì)當(dāng)下臨床上的“超級(jí)細(xì)菌”，磷霉素殼寡糖鹽具有很大的潛力。另外，區(qū)別于市面上現(xiàn)有的磷霉素鹽，磷霉素殼寡糖鹽可以作為一種新的藥物，具有較好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

SW-CJ-1FD 單人單面凈化工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；DNP-9082 電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；YXQ-SG41-280-A 手提式壓力蒸汽滅菌器（上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司）；THZ-C 恒溫振蕩器（太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）；

磷霉素殼寡糖鹽（實(shí)驗(yàn)室自制）；磷霉素鈣（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20180718），牛肉浸膏（生物試劑，上海博微生物科技有限公司，批號(hào)：190514）；蛋白胨（生物試劑，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)：20191116）；硫酸H2SO4（分析純，西隴科學(xué)股份有限公司，批號(hào)：170810）；氯化鈉（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20170608）；氯化鋇（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20180615）；蒸餾水。

1.2 實(shí)驗(yàn)菌株

大腸桿菌ATCC35218（Escherichia coli）、肺炎克雷伯菌ATCC700607（Κlebsiella Pneumoniae）、銅綠假單胞菌ATCC27853（Pseudomonas aeruginosa），由武漢市金銀潭醫(yī)院提供；耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（臨床分離株）（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus）、沙 門 氏 菌CICC21482（Salmonella enteriditis），由武漢工程大學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 待測(cè)新型磷霉素鹽的理化性質(zhì)

本實(shí)驗(yàn)所使用的新型磷霉素殼寡糖鹽由武漢工程大學(xué)實(shí)驗(yàn)室參照相關(guān)文獻(xiàn)［12-13］并做適當(dāng)修改，化學(xué)合成的新型抗菌產(chǎn)品，其結(jié)構(gòu)式如圖1 所示。由于提取終產(chǎn)物時(shí)的溶液pH 值各有不同，導(dǎo)致最終產(chǎn)品性狀有所差異，因此本實(shí)驗(yàn)選擇新合成的5 批樣品進(jìn)行病原菌抑菌作用測(cè)試，5 批產(chǎn)品性狀如表1 所示。

圖1 磷霉素殼寡糖鹽的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure of fosfomycin chitosan oligosaccharide salt

表1 五批樣品性狀Tab.1 Sample characteristics of five batches

1.4 方 法

以微量肉湯稀釋法測(cè)定新型磷霉素殼寡糖鹽對(duì)5 種病原菌的抑菌活性；在-20 ℃冰箱及常溫干燥器環(huán)境下保存7 d，再次以微量肉湯稀釋法測(cè)定抑菌活性，判斷保存條件對(duì)藥品的活性是否有影響。

1.4.1 藥品溶液的配制 取表1 所述5 批實(shí)驗(yàn)室自制［14］新型磷霉素殼寡糖鹽樣品配制成1 mg/mL的藥品溶液；配制1 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)磷霉素鈣溶液，作為實(shí)驗(yàn)藥品的對(duì)照組；制備麥?zhǔn)媳葷峁?，配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%H2SO4溶液與質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%BaCl2溶液，取0.1 mL H2SO4溶液與9.9 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%BaCl2溶液，配制成1 麥?zhǔn)蠞岫裙埽瑩u勻后取5 mL，加入5 mL 無(wú)菌水，制成0.5 麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)管，相當(dāng)于1.5×108CFU/mL。

1.4.2 菌懸液制備 按照配方制備LB 液體培養(yǎng)基，稱取5 g 蛋白胨，1.5 g 牛肉膏，2.5 g 氯化鈉，置于燒杯中，加蒸餾水至500 mL，加熱溶解后分裝、滅菌，使用接種環(huán)分別從大腸桿菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、沙門氏菌斜面上挑取3 環(huán)，分別接入100 mL 液體培養(yǎng)基中，充分振搖，于37 ℃、160 r/min 條件下?lián)u床培養(yǎng)約5 h 左右，使其達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期［15］，作為實(shí)驗(yàn)所用菌懸液。

1.4.3 最低抑菌濃度（MIC）值測(cè)定 將菌液稀釋成相當(dāng)于0.5 麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)的溶液，再用液體培養(yǎng)基以1∶100 倍數(shù)進(jìn)行稀釋，使含菌量數(shù)值達(dá)1.5*106CFU/mL；取無(wú)菌96孔板，于第一個(gè)孔加入100 μL 藥品溶液，第二個(gè)孔加入100 μL 藥品溶液和100 μL 液體培養(yǎng)基，依次倍比稀釋，最后在每個(gè)孔加入80 μL 液體培養(yǎng)基及20 μL 菌懸液，使藥品質(zhì)量濃度梯度依次為，500、250、125、62.5、31.3、15.6、7.8、3.9 μg/mL；在其后一孔加入共180 μL 液體培養(yǎng)基和20 μL 菌液，作為細(xì)菌生長(zhǎng)組對(duì)照，最后一孔加入200 μL 液體培養(yǎng)基，作為培養(yǎng)基對(duì)照組，測(cè)量藥品對(duì)5 種細(xì)菌的MIC 值，以文獻(xiàn)記述方法［16］判定最低抑菌濃度：若細(xì)菌生長(zhǎng)組呈渾濁狀，培養(yǎng)基對(duì)照組呈清澈透明狀，則表明藥品溶液及培養(yǎng)基未受到污染，以梯度藥物組中從低到高依次排列的第一個(gè)清澈透明孔中的藥品濃度為最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）值。本試驗(yàn)同時(shí)做3 組，取平均值作為最終MIC值。MIC 值越低，說(shuō)明藥品抑菌活性越強(qiáng)。

1.4.4 保存條件對(duì)藥品抑菌活性的影響 將藥品配制成1 mg/mL 的溶液進(jìn)行上述MIC 測(cè)定；分別放置于-20 ℃冰箱及常溫干燥器中，保存7 d 后再次測(cè)定其MIC 值；選取第一次實(shí)驗(yàn)結(jié)果中藥品抑制效果較好的菌種作為試驗(yàn)菌，試驗(yàn)條件均相同，通過(guò)測(cè)量其最低抑菌濃度判斷其抑菌效果是否受到影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 新型磷霉素殼寡糖鹽對(duì)5 種病原菌的最低抑菌濃度（MIC）的測(cè)定結(jié)果

新型磷霉素殼寡糖鹽5 批樣品對(duì)5 種病原細(xì)菌的MIC 測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2，從表2 可知，5 批樣品均具有抑菌活性，其中對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌兩種細(xì)菌的抑菌效果都比較好，為3.9～15.6 μg/mL，效果明顯比磷霉素鈣的62.5 μg/mL 要低得多，說(shuō)明本藥品對(duì)這兩種細(xì)菌的抑制效果較強(qiáng)；5 批樣品對(duì)肺炎克雷伯菌的效果也較好，為15.6～52.1 μg/mL，但相比較磷霉素鈣的62.5 μg/mL來(lái)說(shuō)，抑菌效果的提升不高，僅FCOS-2、FCOS-3、FCOS-4 樣品效果比較好，為15.6 μg/mL；5 批樣品對(duì)沙門氏菌的抑菌效果和磷霉素鈣持平，均為104.2～125 μg/mL，與磷霉素鈣的抑菌效果無(wú)明顯差別；5 批樣品對(duì)大腸桿菌的抑菌效果不穩(wěn)定，為15.6～104.2 μg/mL，F(xiàn)COS-3 和FCOS-4 樣品對(duì)大腸桿菌的抑菌效果比磷霉素鈣好（15.6 μg/mL）FCOS-1、FCOS-2 和FCOS-5 的抑菌效果則比磷霉素鈣的31.3 μg/mL 要低，說(shuō)明本樣品還有改進(jìn)的空間。綜合來(lái)看FCOS-3 和FCOS-4 兩批藥品的抑菌效果最好，在后續(xù)的制備中可以參照這兩次的合成方法進(jìn)行合成。

表2 磷霉素殼寡糖鹽對(duì)5 種不同病原菌的最低抑菌質(zhì)量濃度Tab.2 MICs of fosfomycin chitosan oligosaccharide salt against five different pathogens

2.2 新型磷霉素殼寡糖鹽保存條件對(duì)病原細(xì)菌抑菌活性的影響

由上述實(shí)驗(yàn)可知5 批樣品對(duì)Pae 和MRSA 的抑菌效果都比較好，且Pae 本身具有能夠顯色的特性，生長(zhǎng)過(guò)程中可以使培養(yǎng)液變?yōu)榫G色，利于觀察；用同樣效果較好的MRSA 對(duì)藥品進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)，利于對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，由此選用Pae 和MRSA作為保存條件試驗(yàn)的試用菌，保存條件對(duì)磷霉素殼寡糖鹽的抑菌活性影響結(jié)果見(jiàn)表3 和表4。由表可知，本藥品在低溫保存時(shí)穩(wěn)定性較高，前后效果無(wú)明顯差別，MIC 值為3.9～15.6 μg/mL，但將其置于干燥器中常溫保存，效果出現(xiàn)顯著降低，MIC值為125～250 μg/mL，說(shuō)明該藥品在常溫、干燥條件下抑菌活性容易流失，這可能是由于這種條件下有效結(jié)構(gòu)發(fā)生降解，從而影響藥品的抑菌活性，因此在后續(xù)的藥品貯存中應(yīng)盡量在低溫環(huán)境下進(jìn)行保存，避免將藥品放在常溫干燥條件下。

表3 磷霉素殼寡糖鹽對(duì)銅綠假單胞菌的最低抑菌質(zhì)量濃度Tab.3 MICs of fosfomycin chitosan oligosaccharide salt against Pae μg/mL

表4 磷霉素殼寡糖鹽對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的最低抑菌質(zhì)量濃度Tab.4 MICs of fosfomycin chitosan oligosaccharide salt against MRSA μg/mL

3 結(jié) 論

本文對(duì)實(shí)驗(yàn)室自制的5 批新型磷霉素殼寡糖鹽樣品進(jìn)行了MIC 測(cè)定，測(cè)試了對(duì)Eco、MRSA、Pae、Kpn 和Sal 五種菌株的抗菌性能，并對(duì)保存條件對(duì)藥品抑菌活性的影響進(jìn)行研究，相比磷霉素鈣而言，5 批磷霉素殼寡糖鹽樣品都對(duì)Kpn、MRSA和Pae 有較強(qiáng)的抑菌效果，尤其是針對(duì)MRSA 和Pae病原細(xì)菌，MIC 值均小于或等于15.6 μg/mL，顯著低于對(duì)照藥品磷霉素鈣的MIC 值62.5 μg/mL，說(shuō)明本藥品對(duì)這兩種菌有較強(qiáng)的抑制作用，尤其是FCOS-3、FCOS-4、FCOS-5 3 批樣品對(duì)Pae 的抑菌效果為本次實(shí)驗(yàn)的最低濃度梯度，說(shuō)明其具有更強(qiáng)的抑菌潛力，但本藥品對(duì)Kpn 的抑菌效果較為不穩(wěn)定，說(shuō)明還有進(jìn)行深入研究的必要；5 批藥品對(duì)Sal 的抑菌效果和磷霉素鈣基本持平，沒(méi)有特別明顯的差異，F(xiàn)COS-1、FCOS-2、FCOS-5 3 批藥品對(duì)大腸桿菌的抑制效果低于磷霉素鈣，且FCOS-5的抑菌效果明顯較弱，這可能是由于沙門氏菌及大腸桿菌有特別的耐藥機(jī)制［17-18］，使細(xì)菌對(duì)本藥品具有耐藥性，因此針對(duì)這兩種細(xì)菌需要更深入的研究。

本批次藥品的保存條件對(duì)藥品的抑菌活性有較大的影響，在-20 ℃冷藏保存條件下效果穩(wěn)定，但置于常溫干燥環(huán)境下抑菌效果會(huì)大幅下降，因此需要在低溫環(huán)境進(jìn)行貯存。5 批新型磷霉素殼寡糖鹽對(duì)所選菌株均具有抑菌活性，且對(duì)于部分臨床常見(jiàn)菌的效果如Pae 和MRSA 明顯比現(xiàn)有藥品磷霉素鈣好，具有較好的開(kāi)發(fā)前景。

與傳統(tǒng)抗菌劑抗生素相比較，磷霉素殼寡糖鹽具有較強(qiáng)的抑菌性能，但本藥品的合成工藝目前較為不穩(wěn)定，根據(jù)合成條件的不同，得到的產(chǎn)品性能差異較大，需要對(duì)每一批次藥品做抗菌研究，因此對(duì)生產(chǎn)工藝需要進(jìn)一步的研究?？傮w來(lái)看，磷霉素殼寡糖鹽的水溶性和抗菌活性良好，在抗菌領(lǐng)域中具有較大的潛在應(yīng)用價(jià)值，本文為開(kāi)發(fā)具有高效、低毒的新型磷霉素殼寡糖鹽藥物提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。