杜實之

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源環(huán)境學(xué)院，長沙 410128）

納米材料是指在三維空間中至少有一個維度處在納米尺度范圍（1～100 nm）或由它們作為基本單元構(gòu)成的材料.納米材料因為其小尺寸效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)、宏觀量子隧道效應(yīng)等，而表現(xiàn)出獨特的光、電、熱、磁、催化以及生物活性等特殊功能［1］，多用于催化、聚合物的制備以及疾病的診斷和治療等.金屬納米顆粒的廣泛應(yīng)用，也給陸地和水生生態(tài)系統(tǒng)帶來安全風(fēng)險，若水果和谷物中檢測到金屬納米顆粒，它們可能轉(zhuǎn)移到食物鏈并對人類健康構(gòu)成威脅［2］.

金屬納米顆粒的表征對于獲得有關(guān)其性質(zhì)及其應(yīng)用的信息至關(guān)重要，表征技術(shù)的選擇應(yīng)考慮基質(zhì)的復(fù)雜性、分析物濃度和物理化學(xué)特性.目前可以運用多種手段對金屬納米顆粒進行分析與檢測（粒徑、濃度、形態(tài)等），主要的表征手段有顯微鏡及相關(guān)技術(shù)、色譜分析分離方法、質(zhì)譜法等.

經(jīng)過處理的金屬納米顆?？捎糜诟纳妻r(nóng)作物生長，如 Au NPs 可作為生長促進劑［3］；但 Ag NPs 等會對植物的生長會產(chǎn)生負面影響，如破壞蛋白質(zhì)、減弱植物生長力和色素［4］；同時金屬納米顆粒還可能通過推動食物鏈逐級向植物營養(yǎng)鏈的高位富集，直接導(dǎo)致食物鏈中高級生物的毒性效應(yīng)［5］.

本文基于近幾年金屬納米顆粒對于植物的作用機制的研究結(jié)果，系統(tǒng)總結(jié)了納米顆粒的分析測試和表征手段，探討了納米顆粒在植物內(nèi)的吸收、遷移、累積和毒性效應(yīng)，分析了納米顆粒在環(huán)境中的安全性及其在環(huán)境中的歸宿，為今后的納米顆粒對植物的生態(tài)毒理效應(yīng)研究等提供參考.

1 金屬納米顆粒的分析測試與表征手段

由于金屬納米顆粒的特殊性，表征檢測相對復(fù)雜，首先要考慮其濃度和物理化學(xué)性質(zhì)，目前常用的包括顯微鏡表征技術(shù)、電感耦合等離子質(zhì)譜相關(guān)方法以及分離技術(shù)的聯(lián)用.

1.1 顯微鏡及相關(guān)表征技術(shù)

顯微鏡通常用于評估納米顆粒的大小、形狀和顆粒聚集程度，透射電子顯微鏡（TEM）和掃描電子顯微鏡（SEM）是目前最常用的單一顆粒的測量方法.TEM 圖像可用于判斷系統(tǒng)中是否實現(xiàn)了良好的分散或是否存在團聚，也能夠直接觀察液相中金屬納米顆粒的生長［6］，但用TEM 來處理樣品需要消耗一定的時間并且工序復(fù)雜，因為它需要超薄的TEM載體；為了使金屬納米粒子便于后續(xù)處理，常常需要使用負染色材料（如磷酸或衍生物、醋酸尿素等）進行納米粒子的固定；如若實驗材料不足也可以將樣品嵌入冰層中然后在液氮下暴露一定時長［7］.SEM對物質(zhì)進行微觀表征需要先利用高能電子束掃描樣品，再通過光束與物質(zhì)間的相互作用，激發(fā)出樣品的物理性質(zhì)，對這些信息收集、放大、再成像［8］.KASHIN［9］等通過 SEM 觀察獲得了 Pt/Pd合金納米顆粒（5～100 nm）物體的形態(tài)，并描述了納米物體的形態(tài)和尺寸與支撐表面性質(zhì)、金屬和濺射條件的關(guān)系.原子力顯微鏡（AFM）也被用來研究納米顆粒形貌和結(jié)構(gòu)在平面上的分布，它的優(yōu)點是不需要特定的處理，無需繁瑣且可能污染樣品的步驟，只需要制備少量的樣品，就能觀測到聚合納米的微觀結(jié)構(gòu)［10］.

在實際應(yīng)用中，往往將電鏡與能譜（EDS）聯(lián)用，在對材料進行成像的同時也進行元素分析.但這兩種電子顯微鏡檢測樣品除必須在真空條件下外，還需要花費較多的時間和經(jīng)濟成本對樣品進行前處理，且不能對整個樣品進行檢測，具有片面性.而熒光顯微鏡通過對比染色的部位使表征更加清晰，常與其他表征方式聯(lián)用.LEE 等［11］使用透射電子顯微鏡（TEM）用于觀察銀納米顆粒的大小和形貌，通過能量色散光譜（EDS）對樣品進行化學(xué)分析，證明了Ag NPs 被綠豆細胞吸收并且積累（圖 1（a）、（b））.BALA 等［12］等處理水稻葉片后，發(fā)現(xiàn) ZnO NPs 在氣孔開口附近和硅細胞之間以單個顆粒和小團聚體的形式出現(xiàn)，SEM 和EDS 光譜檢測到的強信號證明了ZnO NPs 通過水稻葉表面氣孔進入植物系統(tǒng).電鏡需要精細的樣品制備，速度慢，檢查的顆粒少，但是它可以結(jié)合多種衍射處理衍射方法，使其成為表征金屬納米顆粒非常有價值的輔助手段［13］.

圖1 植物樣品中金屬納米顆粒的表征圖Fig.1 Characterization of metal nanoparticles in plant samples

1.2 電感耦合等離子質(zhì)譜相關(guān)方法

金屬納米材料的新興表征法主要是單顆粒-電感耦合等離子質(zhì)譜法（SP-ICP-MS），其原理是通過稀釋、震蕩等手段使納米顆粒懸浮液達到足夠低的濃度，使一次只有一個納米顆粒進入ICP-MS 系統(tǒng)，并且控制流速；當(dāng)粒子進入等離子體，被蒸發(fā)、霧化、電離后產(chǎn)生的離子通過ICP 導(dǎo)向質(zhì)量分析儀，質(zhì)量分析儀根據(jù)它們的質(zhì)荷比來確定元素濃度進而得到產(chǎn)生瞬間信號的脈沖峰，其強度隨著單個納米顆粒中所含的原子數(shù)增加而增加［14］.

與傳統(tǒng)的ICP-MS 模式相比，SP-ICP-MS 由于其高靈敏度、易用性和分析速度快等特點，目前成為一種理想的測定環(huán)境中納米顆粒的技術(shù)，它不僅可以測量顆粒的多元素組成，還可以推導(dǎo)顆粒物的直徑［15］.由于質(zhì)量選擇性檢測器的靈敏度和快速采集速度，通過SP-ICP-MS 分析的顆粒樣品必須稀釋到足夠低的濃度，確保單位時間只有單個顆粒物進入系統(tǒng)，而不是多個粒子的重疊.SP-ICP-MS 質(zhì)譜儀檢測到的單顆粒物事件所產(chǎn)生的脈沖強度信號與金屬納米顆粒物的質(zhì)量大小/粒徑大小成正比［16］.WEI等［17］使用 SP-ICP-MS 對芥菜和萵苣中的 Au NPs 進行表征，并證實了金納米顆?？梢晕皆谥参锔谋砻妫▓D 2（a））.DAN 等［18］運用 SP-ICP-MS 從番茄植物中提取了Au NPs 但未引起Au NPs 的溶解或聚集，并準確測量出植物基質(zhì)中Au NPs 的大小、尺度分布和顆粒濃度；此法可以用于檢測植物組織的整體，而不是僅僅檢測植物的一小部分，因此可以產(chǎn)生更準確的結(jié)果.

圖2 芥菜、萵苣［17］和番茄［18］通過SP-ICP-MS檢測到的金納米顆粒Fig.2 Au NPs detected by SP-ICP-MS in mustard ，lettuce［17］and tomato［18］

1.3 分離技術(shù)的聯(lián)用

環(huán)境中樣品金屬納米顆粒的低濃度為各種檢測帶來了困難，因此需要采用一些有效的萃取和富集分離方法，在測試同時將納米顆粒從環(huán)境中分離，提高檢測準確度.流體動力色譜（HDC）是色譜分離技術(shù)中的一種，可用于有效分離環(huán)境中納米顆粒，GRAY 等［19］用 HDC 方法分離了河水基中聚苯乙烯、銀和金納米顆粒的復(fù)雜混合物，解決了金屬納米顆粒從其復(fù)雜的環(huán)境矩陣中分離的難題.場流分離系統(tǒng)（field-flow fractionation，F(xiàn)FF）是一套高分辨率的洗脫技術(shù)，非常適用于分離樣品尺寸在1 nm～1 μm 的大分子、膠體及納米顆粒.與其他技術(shù)相比，F(xiàn)FF 技術(shù)不受降解、過濾、分離度或不必要的吸附的限制，降低了每個分析設(shè)備的樣品多分散性和復(fù)雜性，理想情況下還增加了顆粒的大小［20］.SOMCHUE等［21］表明：分離主要基于電泳遷移速率，運用場流分離系統(tǒng)可以表征具有不同粒徑的金屬納米顆粒.不對稱流場流分餾（AF4）可以表征具有不同程度的多分散性的Ag NPs 產(chǎn)物，并且具有更快速和更直接等優(yōu)點［22］.

2 金屬納米顆粒在植物中的積累

納米顆粒對植物的生態(tài)毒理效應(yīng)研究尚處于探索階段，總的來看納米顆粒對于植物個體的作用體現(xiàn)在植物體內(nèi)的積累，從而影響植物的生長和代謝，但是納米顆粒在植物體內(nèi)的積累受到許多環(huán)境因素和納米顆粒特性的影響.

2.1 納米顆粒在植物內(nèi)累積的影響因素

與重金屬等其他污染物不同的是，金屬納米顆粒的粒徑對其性質(zhì)有著很大的影響.對于同等條件下的植物暴露處理時，按照從根部進入的條件來看，粒徑較大的金屬納米顆粒進入植物體內(nèi)的數(shù)量會偏少，如 FALCO 等［23］研究表明 Ag NPs 誘導(dǎo)的蠶豆葉片中PSII光化學(xué)效率、氣孔導(dǎo)度隨著Ag NPs 直徑的減小而增加，這是由于較小納米顆粒的總表面積較大，在固定濃度下對細胞更具毒性和反應(yīng)性而引起的，研究證明了納米顆粒的濃度和其在植物體內(nèi)的累積量成正比，但具體的關(guān)系沒有被發(fā)現(xiàn).植物物種之間的一些物理化學(xué)變化，如導(dǎo)水率的差異、細胞壁的孔徑等，可能會影響納米粒子的運輸和積累［24］.除了納米顆粒本身性質(zhì)的影響之外，環(huán)境因素對納米顆粒在植物中的積累也有影響，比如環(huán)境的pH 值、基質(zhì)的有機質(zhì)含量甚至是土壤中各種根系微生物等都對其有很大的影響［25］.

2.2 金屬納米顆粒進入植物的途徑

對于金屬納米顆粒進入植物體內(nèi)的途徑有兩種主要的看法（圖3）.一部分學(xué)者認為，金屬納米顆粒主要從土壤或者水體中進入植物，通過根系組織進入植物體內(nèi)，從根部向莖和葉遷移，最終可能影響到果實和種子等部位（圖3（a））［26］；另外一部分學(xué)者認為納米顆粒從葉面的氣孔等直接進入植物體內(nèi)，由于植物葉片的氣孔較大，約為1 μm，因此納米顆粒從氣孔進入，由從上至下的方向，向莖和根的方向遷移（圖3（b））［27］.

圖3 納米顆粒從植物根部［26］和葉部［27］暴露的示意圖Fig.3 Schematic diagram of nanoparticles exposed from roots［26］and leaves［27］of plants

也有研究者們對這兩種路徑進行探究，對比分析了大豆和大米對于金屬納米顆粒不同暴露方式的毒性效應(yīng)［28］，結(jié)果表明：同等條件下，從葉片進入植物體內(nèi)累積的銀納米顆粒較多，這也為納米顆粒主要為從上至下的遷移方式提供了依據(jù).

3 金屬納米顆粒對植物的毒性效應(yīng)

3.1 植物生長等宏觀效應(yīng)

納米顆粒對植物的毒性效應(yīng)，與環(huán)境條件密切相關(guān)，如植物生長期（種子、幼苗、成熟期）、納米顆粒的濃度、粒徑尺寸、處理時間均對其毒性效應(yīng)有很大的影響，總的來說，較高濃度納米顆粒會對植物生長發(fā)育產(chǎn)生抑制作用，常見的Ag NPs、Al2O3等在高濃度下均會減少植物生物量和植株生長高度.如 SIDDIQI 等［29］發(fā)現(xiàn) Ag NPs 減少了可食用植物（蔥、卷心菜和生菜）等蔬菜的質(zhì)量，主要是因為Ag NPs 作為乙烯抑制劑并激活植物中的抗氧化劑.而對于幼苗的生長，大多數(shù)都是植物生長高度受到一定的抑制，根系發(fā)育也受到了同步的影響.如BURKLEW 等［30］表明：當(dāng) Al2O3納米顆粒的濃度從0.1%上升至1%時，每株煙草幼苗根的長度、植樹平均高度和葉片數(shù)量均有所下降.

但是，低濃度的納米顆粒并不會給植物帶來任何不利影響，甚至在特殊情況下對植物生長有促進作用，如 ALAGHEMAND 等［31］運用納米氧化鋅噴施黑孜然，相比于對照組，在采用0.2%的鋅納米顆粒噴霧處理的情況下，黑孜然的植株高度從25 cm 增長至75 cm；BEHBOUDI 等［32］發(fā)現(xiàn)在干旱情況下，施用90 mg?L-1的SiO2納米顆粒使旱地植物的葉綠度和相對含水量分別提高了約12%和84%.

SIDDIQI［33］表明：導(dǎo)致兩種不同現(xiàn)象的原因是在較高的濃度下，金屬納米顆粒會產(chǎn)生壓力或毒性并增加植物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)量，使細胞代謝遭到破壞，最終導(dǎo)致植物根的伸長受到抑制和產(chǎn)量明顯下降；而在較低濃度下，金屬納米顆?？梢栽黾由L素（IAA）和光和色素的含量，對植物生長起到促進作用.

3.2 光合作用的影響等微觀效應(yīng)

許多研究也開始探討金屬納米顆粒對于植物光合作用的影響.NPs 通過作用于Rubisco 酶來影響光合作用，F(xiàn)ARAZ 等［34］研究的大多數(shù)金屬納米顆粒都可以增強或抑制Rubisco 酶的活性和光合速率.某些納米顆粒對植物光合結(jié)構(gòu)有不利的影響，尤其是CuO NPs 對其活性有明顯的抑制效應(yīng)，并隨著濃度的增加其抑制效應(yīng)越顯著，導(dǎo)致光合色素減少，葉綠體中的基粒被破壞或者嚴重畸形［35］.然而，TiO2NPs可以提高某些作物（如蠶豆）對低溫脅迫的耐受性，通過激活葉綠體中的光化學(xué)反應(yīng)，增加光合作用運輸鏈中的能量［36］.表1 列舉了一些金屬納米顆粒對植物光合作用的影響效果，發(fā)現(xiàn)其對植物光合作用的影響為有利或有害，它具有改變植物光和效率的能力，KATARIA［37］等表明這可能與金屬納米顆粒對光的敏感程度有關(guān).

表1 金屬納米顆粒毒性效應(yīng)的案例Tab.1 Examples of toxic effects of metal nanoparticles

3.3 金屬納米顆粒對植物毒性效應(yīng)作用機制

與其他大中小顆粒生物材料應(yīng)用相比，NPs 顆?？梢灾苯踊蛘咄高^植物細胞壁和植物細胞膜孔徑進入許多植物細胞內(nèi)部，改變植物細胞膜透性，破壞植物細胞膜的完整性，與植物細胞內(nèi)其他細胞器（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、液泡和細胞吞噬體）相互作用，隨后可能導(dǎo)致細胞和植物遺傳激素水平的嚴重毒性［52］.金屬納米顆粒對植物的毒性作用主要表現(xiàn)在生理水平（如抑制根的生長和延緩植物發(fā)育等）以及細胞水平（如葉綠素合成中斷和細胞膜的損傷等）.

NPs 本身具有較強的表面活性，在吸收能量或接觸生物體內(nèi)的電子供體時會導(dǎo)致細胞內(nèi)ROS 的產(chǎn)生［53］.金屬離子對細胞生化過程和電子傳遞鏈的干擾通常也會導(dǎo)致 ROS 的產(chǎn)生［54］.當(dāng)ROS的水平值超過正常的閾值，其在細胞壁和質(zhì)膜中的積累會導(dǎo)致植物葉片的凋亡和細胞死亡，并通過產(chǎn)生脂質(zhì)衍生基加劇氧化應(yīng)激，自由基的形成會破壞葉綠素合成、脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)變性或染色體畸變，還有研究表明ROS 會降低有絲分裂的指數(shù)，從而損傷細胞［55］（圖4（a））.而在高水平的氧化應(yīng)激下，抗氧化防御系統(tǒng)超載且效率較低.根據(jù)MIRZAJANI等［56］將水稻暴露于Ag NPs 下，RNA/DNA 轉(zhuǎn)錄蛋白及細胞壁均有不同程度的損傷，最終導(dǎo)致了細胞的凋亡；HOSSAIN 等［57］用 Al2O3、ZnO、Ag NPs 來評估大豆幼苗的蛋白質(zhì)水平，發(fā)現(xiàn)參與氧化還原、生長發(fā)育的蛋白質(zhì)均發(fā)生了顯著的變化.金屬納米顆粒對植物的毒性作用水平還取決于許多因素，如納米顆粒物的濃度、大小、理化性質(zhì)、植物種類、植物壽命等［58］（圖4（b））.如前文所述，相對較低的濃度（100 mg·L-1）的NPs 對植物的生長有積極作用，而較高濃度往往會產(chǎn)生相反的效果.

圖4 金屬納米顆粒對植物毒性效應(yīng)及其影響因素［58］Fig.4 Toxic effects of metal nanoparticles on plants and influence factors［58］

從代謝成分變化來看納米顆粒對于植物的毒害效應(yīng)，主要是金屬納米顆粒和微生物細胞之間的靜電吸引力破壞植物代謝活動.ZHANG等［59］從CeO2納米顆粒處理的菠菜葉片的代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)：抗氧化應(yīng)激防御系統(tǒng)受到了影響，即酚類物質(zhì)含量增加，引起菠菜根中氮代謝途徑紊亂，影響氨基酸的合成，使其含量降低.而許多表型參數(shù)（葉綠素?zé)晒?、光合色素含量、植物生物量、脂質(zhì)過氧化、膜透性）不受影響.然而，代謝組學(xué)分析顯示：不同劑量的CeO2NPs 以非劑量依賴的方式誘導(dǎo)葉片和根的代謝通路的變化，低劑量比高劑量更能誘導(dǎo)菠菜葉片的代謝通路的變化.當(dāng)NPs的組成、濃度、大小、形態(tài)和表面涂層發(fā)生變化時，NPs 的結(jié)果也會發(fā)生變化.因此，金屬氧化物NP 的植物毒性機制，如ZnO NPs和Ag NPs，可能來自NPs的物理化學(xué)特性［60］.

4 結(jié)論與展望

納米技術(shù)是一門進化科學(xué)，在電子、能源、醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)領(lǐng)域有許多新的應(yīng)用.由于金屬納米顆粒獨特的性質(zhì)，其對植物的毒理學(xué)效應(yīng)引起廣泛重視.許多研究人員認為，金屬納米顆粒對植物生長和發(fā)育的影響決于納米材料的性質(zhì)、應(yīng)用方式及植物種類.

從已有的研究來看，表征金屬納米的方法主要為顯微鏡表征技術(shù)、電感耦合等離子質(zhì)譜法.顯微鏡表征技術(shù)操作簡單，是目前最常用的單一顆粒測量方法；電感耦合等離子質(zhì)譜法靈敏度高，測量結(jié)果準確，但若想要獲得與金屬納米顆粒相關(guān)的各種特性，比如當(dāng)前最主要的困難——納米尺寸的表征，通常需要多種技術(shù)的結(jié)合；目前納米顆粒的表征技術(shù)仍需要進一步提高準確性和分辨率，同時發(fā)展無損檢測和原位表征技術(shù)等.

金屬納米進入植物的方法有兩種，粒徑較小的金屬納米顆粒容易進入植物體內(nèi)，但環(huán)境對其影響也不可忽視.金屬納米顆粒對植物的生態(tài)毒理效應(yīng)研究還處于起步階段，總體來說，過量的金屬和金屬氧化物納米顆粒對植物有害，而微量存在時對植物有益，但各種金屬納米顆粒的作用機制和毒性效應(yīng)尚未被普遍認可，應(yīng)該更加關(guān)注納米顆粒在植物中的存在形式，考慮在更加復(fù)雜的作用體系下，它們是否會與其他污染物產(chǎn)生協(xié)同或者拮抗作用.除對水培植物樣品的試驗和監(jiān)測，金屬納米顆粒在植物中如何遷移以及是否影響遺傳也是其重要內(nèi)容，還需要更多的研究來探索它們與生物分子的相互作用及其對植物基因表達調(diào)控的影響.