顏華，趙康康，張媛，陳歡，郝鵬澤，賈良輝

（西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，楊凌 712100）

鏈霉菌是一類具有分枝狀菌絲體的革蘭氏陽性菌，抗生素的主要來源之一，鏈霉素、四環(huán)素、萬古霉素等均由鏈霉菌合成［1］.鏈霉菌次生代謝是在特定生長狀態(tài)下，受形態(tài)分化、環(huán)境脅迫的影響而進(jìn)行的［2］，受到多層次嚴(yán)密調(diào)控.通常，次生代謝過程會受全局性和途徑特異的調(diào)控因子的控制［3-4］.全局性調(diào)控基因常位于次生代謝合成基因簇外部，負(fù)責(zé)對碳氮源、pH、鹽離子濃度等環(huán)境信號做出響應(yīng)，調(diào)控下游基因的表達(dá)；全局性調(diào)控基因可能控制多種代謝途徑并間接地影響次生代謝［5-7］.而途徑特異性調(diào)控基因常位于次生代謝合成基因簇內(nèi)部，直接影響簇內(nèi)基因的表達(dá).

寡霉素是一類由放線菌產(chǎn)生的二十六元大環(huán)內(nèi)酯類化合物，具有多種生物學(xué)活性.寡霉素對黑曲霉（Aspergillus niger）、新月彎孢菌（Curvularia lunata）、多孔木霉（Tolypocladium inflatum）等有顯著的抑制活性［8］.寡霉素能誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡具有抗腫瘤活性.在以線粒體為靶標(biāo)的37000 個化合物對人類60個腫瘤細(xì)胞株的抗癌活性試驗(yàn)中，寡霉素是效果最好的37 種化合物之一［9］.寡霉素也能抑制線粒體氧化磷酸化，被廣泛應(yīng)用于線粒體功能紊亂有關(guān)疾病及程序性死亡等相關(guān)研究［10］.目前，雖然寡霉素尚未被利用在臨床上，但作為ATP 合酶抑制劑，具有重要的科學(xué)意義.而且，寡霉素抑制多種病原真菌的能力，預(yù)示了其在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用潛力.

密旋鏈霉菌（Streptomyces pactum）Act12 全基因組預(yù)測含有30 個次生代謝合成基因簇.其中，寡霉素合成基因簇全長183189 bp，有9 個可能的核心生物合成酶基因、10 個可能的調(diào)控基因.最靠近核心生物合成酶基因的兩個調(diào)控基因分別是LuxR-2306、LuxR-2307，推測其可能作為途徑特異調(diào)控因子控制寡霉素的生物合成. 灰色鏈霉菌（Streptomyces griseus）中，全局性調(diào)控因子AdpA 可激活許多與形態(tài)分化和次生代謝相關(guān)基因的表達(dá)，使其分化形成氣生菌絲和孢子，同時合成鏈霉素和黃色色素［11］.在密旋鏈霉菌Act12 中，也存在AdpA 的同源基因AdpA-s（為便于區(qū)分，將 Act12 中的 AdpA 同源基因命名為AdpA-s），推測其可能作為全局性調(diào)控因子控制Act12的形態(tài)分化和次生代謝.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

菌株：密旋鏈霉菌（Streptomyces pactum）Act12；大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α、S17-1；蘋果腐爛菌（Valsa mali）. 質(zhì)粒：大腸桿菌-鏈霉菌穿梭質(zhì)粒pKC1139（Aprr），含鏈霉菌溫度敏感pSG5 復(fù)制子，用于構(gòu)建阻斷突變株；pSET152：：PermE*，含紅霉素抗性基因的強(qiáng)啟動子，用于構(gòu)建高表達(dá)菌株（均由本實(shí)驗(yàn)室保存）.

1.1.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

培養(yǎng)鏈霉菌使用高氏一號固體培養(yǎng)基；鏈霉菌種子培養(yǎng)采用TSB 培養(yǎng)基；鏈霉菌發(fā)酵采用SPY 培養(yǎng)基（胰蛋白胨0.2%，酵母提取物0.4%，可溶性淀粉1%，氯化鈉0.8%，pH 7.2）；結(jié)合轉(zhuǎn)移采用2CMY 培養(yǎng)基（胰蛋白胨0.2%，可溶性淀粉1%，氯化鈉0.1%，硫酸銨0.2%，磷酸氫二鉀0.1%，碳酸鈣0.2%，硝酸鉀0.1%，無機(jī)鹽溶液，瓊脂1.6%）；蘋果腐爛菌培養(yǎng)采用PDA 培養(yǎng)基.大腸桿菌培養(yǎng)采用LB 培養(yǎng)基.鏈霉菌培養(yǎng)溫度為28 ℃；蘋果腐爛菌培養(yǎng)溫度為30 ℃；大腸桿菌培養(yǎng)溫度為37 ℃.

1.1.3 引物

引物由上海生工合成，引物序列見表1.劃線序列代表基因特異性引物，未劃線代表同源臂.

表1 PCR引物序列Tab.1 PCR primer sequence

1.1.4 抗生素、酶

安普霉素（Apr）、卡那霉素（Kan）、萘啶酮酸（Nal）均配成100 mg/mL 高濃度儲備液于-20 ℃保存. LB 培養(yǎng)基中，安普霉素使用濃度是50 μg/mL.高氏一號和2CMY 培養(yǎng)基中，安普霉素和卡那霉素使用濃度是10 μg/mL，萘啶酮酸使用濃度是25 μg/mL.限制性內(nèi)切酶和基因轉(zhuǎn)錄分析相關(guān)的酶均購自賽默飛.高保真DNA 聚合酶購自TaKaRa.同源重組酶購自南京諾唯贊.Trizol 試劑購自北京擎科.

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1.2 阻斷突變株和高表達(dá)菌株的構(gòu)建

1.2.1 阻斷突變株的構(gòu)建

整個過程分兩階段完成，即構(gòu)建重組密旋鏈霉菌Act12（pKC1139-U-KANA-D）和篩選雙交換基因阻斷菌株.

構(gòu)建Act12（pKC1139-U-KANA-D）：首先，通過多片段同源重組的方法構(gòu)建S17-1（pKC1139-UKANA-D）.然后，通過結(jié)合轉(zhuǎn)移的方式將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Act12中，獲得Act12（pKC1139-U-KANA-D）.

篩選雙交換基因阻斷菌株：將Act12（pKC1139-U-KANA-D）涂布于高氏一號固體培養(yǎng)基（kan+），40 ℃培養(yǎng)一周左右，挑取單克隆孢子接種至高氏平板，28 ℃擴(kuò)大培養(yǎng).然后，將單克隆孢子接種于TSB培養(yǎng)基（Kan+Apr+），28 ℃、140 r/min 培養(yǎng)，不能生長的推定為雙交換基因阻斷株.最后通過測序驗(yàn)證，獲得發(fā)生雙交換的基因阻斷菌株.

1.2.2 高表達(dá)菌株的構(gòu)建

首先，采用同源重組的方法構(gòu)建重組大腸桿菌S17-1（pSET152：：PermE*-Target gene）.然后，通過結(jié)合轉(zhuǎn)移的方式將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Act12 中，獲得高表達(dá)菌株Act12（pSET152：：PermE*-Target gene）.

1.3 密旋鏈霉菌Act12 在發(fā)酵培養(yǎng)基（SPY）中生長曲線測定

從培養(yǎng)Act12的高氏一號固體培養(yǎng)基（7 d）中刮取1 cm2的新鮮孢子接種于含有100 mL TSB 種子培養(yǎng)液的250 mL 錐形瓶中，28 ℃、180 r/min 培養(yǎng)2 d.按1∶10 的比例接種于含有40 mL SPY 發(fā)酵培養(yǎng)液的 100 mL 錐形瓶中，28 ℃、180 r/min 發(fā)酵培養(yǎng) .每隔12 h 取樣，抽濾、蒸發(fā)至恒重后，稱量細(xì)胞干重.每組3 個重復(fù).以培養(yǎng)時間（h）為橫坐標(biāo)，細(xì)胞干重（g）為縱坐標(biāo)繪制生長曲線.

1.4 發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性測定

種子液培養(yǎng)同1.3，然后按1∶10 的接種量接種于含有200 mL SPY 發(fā)酵培養(yǎng)液的500 mL 錐形瓶中，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)7 d.將發(fā)酵液按1∶1的比例用乙酸乙酯萃取兩次（發(fā)酵液與乙酸乙酯混合后，于搖床中18 ℃、115 r/min 旋渦震蕩萃取24 h），并收集上層有機(jī)相（約400 mL）后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干. 2 mL 甲醇溶解萃取剩余物，0.45 μm 有機(jī)濾膜過濾除菌后，-20 ℃保存.

抑菌實(shí)驗(yàn)采用濾紙片法.取活化后直徑為0.5 cm的蘋果腐爛菌菌餅，置于新的PDA 平板的中央.在距離中央相等的位置放4 張直徑為0.6 cm 的濾紙片，其中一張濾紙片上滴加15 μL甲醇，另外三張濾紙片上分別滴加15 μL發(fā)酵萃取液.30 ℃培養(yǎng)2～3 d，記錄抑菌圈大小.

1.5 發(fā)酵液中寡霉素的HPLC分析

高效液相色譜采用C18 反向?qū)游鲋约状紴榱鲃酉?梯度洗脫程序?yàn)椋?～5 min 10%甲醇、5～35 min 10%～100%甲醇、35～45 min 100% 甲醇、45～50 min 100%～10%甲醇.進(jìn)樣量10 μL，流速1 mL/min，檢測波長210 nm.

1.6 基因的轉(zhuǎn)錄分析

收集發(fā)酵培養(yǎng)4 d 的菌體提取總RNA，方法參照北京擎科Trizol 試劑盒說明書.cDNA 的合成及實(shí)時熒光定量PCR的操作參考Thermo Fisher Scientific試劑公司相關(guān)產(chǎn)品的說明書.

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵萃取液抑生活性檢測

Act12、LuxR-2306 HE、Spa LuxR-2306、AdpA-s HE、Spa AdpA-s 菌株對蘋果腐爛菌的抑生活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（圖1），陽性對照100 μg/mL 的寡霉素A/B/C 混合物（甲醇溶液配制）對蘋果腐爛菌表現(xiàn)出極強(qiáng)的抑生活性（圖1（b））.較于野生型Act12，Spa LuxR-2306 菌株完全失去了對蘋果腐爛菌的抑生活性，LuxR-2306 HE 菌株對蘋果腐爛菌的抑生活性更強(qiáng)（圖1（c））.然而，同樣與野生型比較，Spa AdpA-s 對蘋果腐爛菌的抑生活性無顯著差別，AdpA-s HE抑制蘋果腐爛菌生長的能力則要更強(qiáng)（圖1（d））.這說明AdpA-s和LuxR-2306均能增強(qiáng)對蘋果腐爛菌生長的抑生活性，且可能是以促進(jìn)抑菌物質(zhì)的合成來實(shí)現(xiàn)的.

圖1 發(fā)酵萃取液對蘋果腐爛菌的抑生活性檢測Fig.1 The antimicrobial activity test of extrated fermentation

2.2 發(fā)酵萃取液中寡霉素D含量的檢測

較于野生型 Act12（圖 2（b）），Spa LuxR-2306 徹底喪失了合成寡霉素D 的能力（圖2（c）），LuxR-2306 HE 合成寡霉素D 的能力增強(qiáng)，產(chǎn)量提高了113%（圖2（b））；Spa AdpA-s 中寡霉素D 產(chǎn)量差異不大（圖2（e）），但 AdpA-s HE 寡霉素D 的合成能力卻顯著增強(qiáng)，產(chǎn)量提高了78%（圖2（f））.這說明AdpA-s 和LuxR-2306 可通過正向調(diào)控寡霉素D 的生物合成，增強(qiáng)對蘋果腐爛菌的抑生活性.另外，與途徑特異性調(diào)控因子LuxR-2306 相比，全局性調(diào)控因子AdpA-s 對寡霉素D 合成的促進(jìn)作用明顯要弱；且AdpA-s的缺失并沒能降低寡霉素D 的產(chǎn)量.

圖2 發(fā)酵萃取液中寡霉素含量的檢測（檢測波長210 nm）Fig.2 The oligomycin D test of extrated fermentation（detected at 210 nm）

2.3 AdpA-s 和LuxR-2306 正向調(diào)控寡霉素的生物合成

Act12 中 AdpA-s、LuxR-2306 轉(zhuǎn)錄水平與寡霉素D生物合成核心酶基因轉(zhuǎn)錄水平之間的調(diào)控關(guān)系，通過實(shí)時熒光定量PCR進(jìn)行檢測.結(jié)果表明，LuxR-2306敲除后，AdpA-s 轉(zhuǎn)錄水平顯著下降（圖3（b））；同時，AdpA-s基因敲除后，LuxR-2306的轉(zhuǎn)錄水平也顯著下降（圖3（c））.這說明AdpA-s和LuxR-2306間可能存在一定的反饋調(diào)節(jié)作用.在Spa LuxR-2306中，寡霉素生物合成核心酶基因2298/2302/2305的轉(zhuǎn)錄水平顯著低于野生型 Act12；然而，在 LuxR-2306 HE 中，2298/2302/2305 的轉(zhuǎn)錄水平則顯著高于野生型（圖3（d/e/f））.這說明LuxR-2306可能通過促進(jìn)寡霉素核心合成酶基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而促進(jìn)寡霉素D的生物合成.

圖3 AdpA-s和LuxR-2306正向調(diào)控寡霉素D的生物合成Fig.3 AdpA-s and LuxR-2306 positively regulate biosynthesis of oligomycin D

3 討論

在高氏一號固體培養(yǎng)基中Spa AdpA-s 不能發(fā)育形成孢子體，說明AdpA-s 能調(diào)控孢子的發(fā)育形成（數(shù)據(jù)未發(fā)表）.在AdpA-s HE 和LuxR-2306 HE 中寡霉素產(chǎn)量顯著增加，表明AdpA-s 和LuxR-2306 能正向調(diào)控寡霉素的生物合成.轉(zhuǎn)錄分析表明LuxR-2306能顯著的影響寡霉素核心合成酶基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)寡霉素的生物合成.而全局性調(diào)控因子AdpA-s和LuxR-2306 之間則存在一定的反饋效應(yīng)，AdpA-s可能是通過間接影響LuxR-2306 的轉(zhuǎn)錄，從而間接地影響了寡霉素的合成.后續(xù)實(shí)驗(yàn)將對此展開進(jìn)一步的深入研究與論證.從而為研究生防菌內(nèi)活性產(chǎn)物的代謝調(diào)控提供一定的理論依據(jù)，為提高生防菌活性奠定基礎(chǔ).

近年來，許多放線菌被報(bào)道具有抗病原真菌活性并作為微生物農(nóng)藥用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐.李曉華等從湖北神農(nóng)架土壤中篩選到一株鏈霉菌Iβ1，抑菌實(shí)驗(yàn)表明該株菌對多種農(nóng)作物病原真菌具有抑制活性［12］.曾夏冬等篩選的水稻內(nèi)生放線菌OsiLf2、OsiSh-2對稻瘟病菌有較好的抑制效果，且能一定程度促進(jìn)水稻幼苗的生長，在稻瘟病的生物防治方面有較大的應(yīng)用潛力［13］.密旋鏈霉菌 Act12 是一株從青藏高原土壤中分離到的放線菌，對草莓、甜瓜等園藝作物有良好的促生作用［14-15］；結(jié)合腐植酸鉀配施能促進(jìn)丹參生長，提高產(chǎn)量及抗病蟲能力［16］.目前，Act12 憑其促生功能已作為一種微生物肥料投入農(nóng)業(yè)生產(chǎn).本研究將全局性調(diào)控因子AdpA-s和途徑特異性調(diào)控因子LuxR-2306 高表達(dá)后，寡霉素D的產(chǎn)量顯著提高，并且對植物病原真菌-蘋果腐爛菌的抑制作用也明顯增強(qiáng).密旋鏈霉菌Act12 內(nèi)活性次級代謝生物合成的調(diào)控機(jī)制的研究，利于對其進(jìn)一步開發(fā)利用，同時有望通過基因工程手段獲得高活性生防菌株個體用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，具有重要的實(shí)踐意義.