劉凱凱， 田國(guó)慶， 張福強(qiáng)， 王二歡， 馬存德， 劉林軍， 李方剛， 任振麗

(1.山東步長(zhǎng)制藥股份有限公司， 山東 菏澤 274000； 2.陜西步長(zhǎng)制藥有限公司， 陜西 咸陽(yáng) 712000)

中藥甘松為敗醬科植物甘松(NardostachysjatamansiDC.)的干燥根、莖，其性辛、甘，溫，無(wú)毒，歸脾、胃經(jīng)。具有理氣止痛，開(kāi)郁醒脾的功效。內(nèi)服用于脘腹脹滿、食欲不振、嘔吐；外用可治療牙痛、腳腫[1]。甘松藥用歷史悠久，是中醫(yī)臨床常用藥材，也是古印度尤納尼和阿育吠陀醫(yī)學(xué)體系的常用品種[2-3]。野生甘松生長(zhǎng)在海拔2 600～5 000 m的高原草地、灌木叢，主要分布在我國(guó)四川、西藏、甘肅、青海等省份的藏區(qū)，生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)，野生資源一旦破壞需要多年才能恢復(fù)。

近年來(lái)，甘松除藥用外，在食品和化妝品領(lǐng)域也被廣泛應(yīng)用，市場(chǎng)需求量不斷增大，無(wú)序采挖使野生資源遭到嚴(yán)重破壞。如何保護(hù)和恢復(fù)甘松資源是當(dāng)前急需解決的問(wèn)題。人工栽培和野生撫育是中藥資源保護(hù)的常用方法，而甘松種子萌發(fā)研究是實(shí)現(xiàn)人工栽培和野生撫育的基礎(chǔ)。目前，對(duì)于甘松的研究多集中在生藥學(xué)和藥理學(xué)領(lǐng)域[4-6]，尚未發(fā)現(xiàn)甘松種子萌發(fā)研究的相關(guān)報(bào)道。因此，開(kāi)展甘松種子萌發(fā)研究的意義重大。為探索甘松種子的萌發(fā)特性，本試驗(yàn)對(duì)其發(fā)芽床、溫度、光照、基質(zhì)含水量和消毒浸種進(jìn)行研究，以期為甘松人工栽培和野生撫育提供一定的實(shí)踐參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為甘松種子，于2020年7月采自甘肅省宕昌縣步長(zhǎng)甘松試驗(yàn)田，種子采收后陰干，去除雜質(zhì)，置于4 ℃冰箱中保存待用，10月份選取健康飽滿的甘松種子進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1種子特性測(cè)定

種子形態(tài)：從樣品中隨機(jī)取100粒健康甘松種子，觀察甘松種子形態(tài)、色澤及表面特征，并測(cè)定種子的長(zhǎng)度(不計(jì)入萼齒)和寬度，確定種子大小范圍。

種子千粒重：采用千粒法測(cè)定甘松種子千粒重，重復(fù)3次。

種子含水量：取甘松種子10 g，采用高溫烘干法對(duì)種子含水量進(jìn)行測(cè)定，重復(fù)3次。

種子生活力：取甘松種子50粒，采用氯化三苯基四氮唑法(TTC法)測(cè)定種子生活力，重復(fù)3次。

1.2.2種子吸水率測(cè)定

取50粒甘松種子用天平(1/10 000)測(cè)定初始質(zhì)量，然后置于燒杯中，加入50 mL蒸餾水，分別于1、2、4、6、10、18、24、32、48 h取出種子，用吸水紙吸干種子表面水分，精密稱重，重復(fù)3次。 按下列公式計(jì)算種子吸水率。

吸水率(%)=[(種子吸水后質(zhì)量-初始質(zhì)量)/初始質(zhì)量]×100%。

1.2.3單因素試驗(yàn)

發(fā)芽床試驗(yàn)：分別以紗布、濾紙(雙層)、蛭石、河沙和脫脂棉作為發(fā)芽床，進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，每個(gè)處理50粒，重復(fù)3次，測(cè)定種子萌發(fā)參數(shù)。

溫度試驗(yàn)：分別設(shè)15、20、25、30 ℃恒溫處理進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，每個(gè)處理50粒，重復(fù)3次，測(cè)定種子萌發(fā)參數(shù)。

光照試驗(yàn)：設(shè)置培養(yǎng)箱每天光照時(shí)間為0、12、24 h三個(gè)處理進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，每個(gè)處理50粒，重復(fù)3次，測(cè)定種子萌發(fā)參數(shù)。

基質(zhì)含水量試驗(yàn)：采用王璐瑤[7]的方法以烘干至恒重的細(xì)沙30 g為發(fā)芽床(厚約0.5 cm)，分別加入1.5、3、6、9 mL蒸餾水，使細(xì)沙含水量為5%、10%、20%、30%。每天稱量培養(yǎng)皿，補(bǔ)充因蒸發(fā)損失的水分，保持恒定的含水量。每個(gè)處理50粒，重復(fù)3次，測(cè)定種子萌發(fā)參數(shù)。

細(xì)沙含水量=(水的質(zhì)量/干沙的質(zhì)量)×100%。

1.2.44種消毒試劑不同浸種時(shí)間對(duì)甘松種子萌發(fā)的影響

甘松種子先用蒸餾水浸泡24 h，以其為對(duì)照(ck)，然后在0.5%KMnO4、75%C2H5OH、3%H2O2、4%NaClO溶液中分別浸泡10、20、30 min，并用蒸餾水沖洗干凈，測(cè)定其發(fā)芽率和霉變率，每處理50粒種子，重復(fù)3次。

霉變率(%)=(14 d種子發(fā)霉數(shù)/供試種子數(shù))×100%。

1.3 發(fā)芽參數(shù)測(cè)定

每日定時(shí)統(tǒng)計(jì)甘松種子發(fā)芽數(shù)，測(cè)定發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)。計(jì)算公式如下：

發(fā)芽勢(shì)(%)=(7 d種子發(fā)芽數(shù)/供試種子數(shù))×100%；

發(fā)芽率(%)=(14 d萌發(fā)種子數(shù)/供試種子數(shù))×100%；

發(fā)芽指數(shù)=∑Gt/Dt(Gt為時(shí)間t的發(fā)芽數(shù)，Dt為相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù))。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2019軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，DPS 7.05軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用Origin 2018軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘松種子特性

如圖1所示甘松種子為倒卵形，3室中1室發(fā)育為瘦果(由于3室難以分離，生產(chǎn)中將整個(gè)果實(shí)視為一粒種子)；上端伴有小萼齒，腹部隆起，下端稍尖；背面突起呈橢圓狀，腹面略平，中間有1條腹溝，腹溝貫穿整個(gè)腹部，種色為灰褐色；種子長(zhǎng)(4.59±0.43)mm，寬(2.68±0.34)mm；種子千粒重為(6.08±0.06)g；含水量為(11.05±0.41)%；生活力為(69.33±3.06)%。

圖1 甘松種子

2.2 甘松種子吸水率

由圖2可看出，甘松種子前4 h快速吸水，4 h時(shí)種子吸水率達(dá)51.22%，4～24 h吸水速率逐漸變緩，24 h時(shí)種子吸水率達(dá)90.12%。24 h后趨于穩(wěn)定，基本達(dá)到飽和狀態(tài)?？梢钥闯?，甘松種子具有良好的吸水性。

圖2 甘松種子吸水率

2.3 單因素試驗(yàn)

2.3.1發(fā)芽床對(duì)甘松種子萌發(fā)的影響

由表1可見(jiàn)，不同發(fā)芽床的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)差異較大。5種發(fā)芽床的發(fā)芽率在41.33%～52.00%之間，發(fā)芽勢(shì)在29.33%～41.33%之間，其中河沙的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)均最高，而雙層濾紙、蛭石、河沙和脫脂棉處理之間的發(fā)芽指數(shù)無(wú)顯著性差異，但均顯著高于紗布。綜合分析，選用河沙作為甘松種子的發(fā)芽床最為適宜。

表1 發(fā)芽床對(duì)甘松種子萌發(fā)的影響

2.3.2溫度對(duì)甘松種子萌發(fā)的影響

由表2可以看出，甘松種子不同溫度下的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)均不同。發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)在25 ℃條件下均為最高，20 ℃和30 ℃次之，15 ℃最低。但在20 ℃與25 ℃條件下種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)均無(wú)顯著性差異，表明甘松種子萌發(fā)的最適溫度區(qū)間為20～25 ℃。

表2 溫度對(duì)甘松種子萌發(fā)的影響

2.3.3光照時(shí)間對(duì)甘松種子萌發(fā)的影響

由表3可以看出，甘松種子在12 h光照條件下發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)最高，分別為55.33%、40.00%和5.51。12 h光照比0 h光照的發(fā)芽率高4.66%，比24 h全光照的發(fā)芽率高7.33%，但三種光照條件下的發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)無(wú)顯著性差異，說(shuō)明光照時(shí)間過(guò)短或過(guò)長(zhǎng)都會(huì)降低其萌發(fā)率，但對(duì)種子出苗整齊度和發(fā)芽能力影響不大。

表3 光照時(shí)間對(duì)甘松種子萌發(fā)的影響

2.3.4基質(zhì)含水量對(duì)甘松種子萌發(fā)的影響

由表4可知，隨著基質(zhì)含水量的增加，發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)表現(xiàn)為先增后降的趨勢(shì)。其中10%基質(zhì)含水量的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)最高，分別為54.00%、38.67%和5.08。10%與20%基質(zhì)含水量的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)均無(wú)顯著性差異，但顯著高于其他處理。因此，適宜甘松種子萌發(fā)的基質(zhì)含水量為10%～20%。

表4 基質(zhì)含水量對(duì)甘松種子萌發(fā)的影響

2.4 4種消毒試劑不同浸種時(shí)間對(duì)甘松種子萌發(fā)的影響

2.4.1甘松種子發(fā)芽率

由圖3可知，甘松種子在4種溶液中不同浸種時(shí)間的發(fā)芽率差異較大。在75%C2H5OH和3%H2O2處理中，發(fā)芽率隨著浸種時(shí)間增加而減小。兩者浸種10 min處理的發(fā)芽率最高，為50.00%和58.67%，比ck的發(fā)芽率高10.00%和18.67%。在0.5%KMnO4處理中，浸種30 min的發(fā)芽率顯著高于其他處理，其發(fā)芽率為58.00%，比ck的發(fā)芽率高18.00%。在4%NaClO處理中，發(fā)芽率隨著浸種時(shí)間增加表現(xiàn)為先增大后減小的趨勢(shì)，浸種20 min的發(fā)芽率最高，為50.00%，比ck的發(fā)芽率高10.00%。相比之下，甘松種子在3%H2O2浸種10 min或0.5%KMnO4浸種30 min的發(fā)芽率更高，因此，選用這兩種方式進(jìn)行浸種，有利于甘松種子的萌發(fā)。

注：圖中不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)。下同。圖3 甘松種子在不同消毒溶液和浸種時(shí)間的發(fā)芽率

2.4.2甘松種子霉變率

由圖4可知，甘松種子的霉變率在4種消毒溶液浸種后均顯著降低，且隨著浸種時(shí)間的增加而減小。在3% H2O2和4%NaClO處理中，三種浸種時(shí)間的霉變率無(wú)顯著性差異，浸種30 min的霉變率最低，為8.67%和9.33%，比ck的霉變率分別降低了16.66%和16.00%。在0.5%KMnO4和75%C2H5OH處理中，浸種30 min處理的霉變率最低，為10.00%和7.33%，比ck的霉變率降低了15.33%和18.00%。

圖4 甘松種子在不同消毒溶液和浸種時(shí)間的霉變率

3 結(jié)論與討論

影響種子萌發(fā)的因素可分為內(nèi)部生理因素和外部環(huán)境因素兩大類，不同植物影響其種子萌發(fā)的因素不同[8-9]。就內(nèi)部生理因素而言，甘松種子為小粒瘦果，吸水性較好，24 h基本達(dá)到吸水飽和，不存在種皮萌發(fā)障礙。但健康飽滿的甘松種子三室中一室發(fā)育，生活力僅為69.33%，說(shuō)明甘松種子成熟比例不高，部分種子未達(dá)到生理成熟。這可能與甘松的生長(zhǎng)環(huán)境有關(guān)，甘松生長(zhǎng)在高原草地，每年生長(zhǎng)期較短，種子成熟期間惡劣天氣較多，易造成種子的成熟度不高，怎樣提高甘松種子成熟度是下一步要研究的重點(diǎn)問(wèn)題。

溫度、光照、水分等外部環(huán)境因素對(duì)種子萌發(fā)也有很大影響[10-12]。溫度影響植物體內(nèi)的酶活性，適宜的溫度才能促使種子萌發(fā)[13]。在本試驗(yàn)中，通過(guò)對(duì)影響甘松種子萌發(fā)的幾個(gè)重要因素進(jìn)行單因素分析，發(fā)現(xiàn)溫度對(duì)種子萌發(fā)的影響最大，在20～25 ℃時(shí)種子的發(fā)芽率和整齊度較高，溫度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)影響甘松種子的萌發(fā)。水分是影響種子萌發(fā)的關(guān)鍵生態(tài)因素[14]，隨著基質(zhì)含水量的增加，甘松種子的發(fā)芽率和整齊度表現(xiàn)為先高后低的趨勢(shì)。適宜種子萌發(fā)的含水量為10%～20%，缺乏水分或水分過(guò)多都不利于甘松種子的萌發(fā)，尤其在水分過(guò)多時(shí)，甘松種子萌發(fā)受到嚴(yán)重抑制。保水透氣的發(fā)芽床能夠促進(jìn)種子萌發(fā)，種子在不同發(fā)芽床萌發(fā)的效果不同[15]。本試驗(yàn)中不同發(fā)芽床的發(fā)芽率在41.33%～52.00%之間，差異較大，其中河沙的發(fā)芽率最高，適宜作為甘松種子的發(fā)芽床。光照對(duì)于甘松種子的萌發(fā)也有較大影響[16]，光照12 h種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)均高于光照0 h或24 h。除了上述外界環(huán)境因素外，還發(fā)現(xiàn)消毒試劑浸種不但可以降低甘松種子的霉變率，還能影響其發(fā)芽率。甘松種子在3%H2O2溶液中浸種10 min或在0.5%KMnO4溶液中浸種30 min均能顯著提高發(fā)芽率。

綜上，不同滅菌方式及不同濃度梯度的PEG處理玉米后，主要影響著玉米萌發(fā)過(guò)程中的發(fā)芽指數(shù)和處理6 d后的發(fā)芽率。。