王彥云，王濟世，劉曉夏，趙璐瑤，楊曙明

（中國農業(yè)科學院農業(yè)質量標準與檢測技術研究所，北京 100081）

中國有4 000 多年的養(yǎng)鯉歷史，是鯉生產與消費大國。目前，我國養(yǎng)殖的鯉品種主要為“3 大系列1 個品系6 個新品種”，分別為德國鏡鯉選育系、荷包紅鯉抗寒品系、豫選黃河鯉新品系，豫選黃河鯉、松浦鏡鯉、松荷鯉和福瑞鯉，六個品種占了我國鯉主產區(qū)80%的鯉養(yǎng)殖品種。黃河鯉是目前市場上主要的鯉養(yǎng)殖品種之一，主要是黃河流域省份養(yǎng)殖和食用。黃河鯉價格高，具有較高的經濟價值，受經濟利益驅使，部分養(yǎng)殖者引進其他鯉假冒黃河鯉，以謀求較高的經濟回報。這種做法，既侵犯了消費者合法權益、損害了黃河鯉的名聲，也使得相關產業(yè)經營受損，黃河鯉從業(yè)者的生產積極性嚴重受挫，黃河鯉真實性問題亟待解決。

當下，主要基于傳統(tǒng)形態(tài)學方法鑒別鯉。由于鯉生物多樣性下降、鯉品質降低、種質退化和魚肉加工升級等的影響，依靠傳統(tǒng)形態(tài)學方法鑒定黃河鯉品種存在諸多困難，給養(yǎng)殖者和消費者造成極大的困擾[1-7]，利用SNP 標記技術則可克服以上缺點。

SNP（Single Ncleotide Polymorphism）又名單核苷酸多態(tài)性，是基因組水平上單個堿基的變異所引起的DNA 序列的多態(tài)性，屬于第三代遺傳標記技術。由于SNP 標記具有存在廣泛、富有代表性、遺傳穩(wěn)定性以及易實現(xiàn)分析的自動化等特點，被廣泛應用于種質鑒定、產品溯源等[8-16]。

1 材料與方法

1.1 DNA 樣品的準備

實驗樣品共6 個品種320 個樣品，包括黃河鯉（Cyprinus carpio）（n=70）、荷包紅鯉（Cyprinus carpio Red var wuyuanensis）（n=50）、福瑞鯉（福瑞鯉2 號，n=50）、松浦鏡鯉（Cyprinus carpio songpu mirror carp）（n=50）、建鯉（Cyprinus carpio var）（n=50）和豐鯉（Cyprinus carpio）（n=50）。這6 個品種包含了黃河鯉主產區(qū)常見鯉品種。黃河鯉樣品包括豫選黃河鯉和野生黃河鯉，其中河南省水產研究院豫選黃河鯉原種36 尾，農業(yè)部黃河鄭州段野生黃河鯉34 尾；荷包紅鯉樣品采自國家級婺源荷包紅鯉良種場；福瑞鯉為最新福瑞鯉二號品種，采自國家新品種福瑞鯉河北繁育基地（唐山市豐南區(qū)豐越泥鰍養(yǎng)殖有限公司）；松浦鏡鯉、建鯉和豐鯉樣品采自養(yǎng)殖戶。所有樣品均使用國標方法進行了鑒定[17-20]，所有樣品品種無誤。引物由上海翼和應用生物技術有限公司合成。

驗證樣本從遼寧、山東、河南、四川等鯉養(yǎng)殖大省收集，共有40 個不同鯉樣本。以黃河鯉之名銷售的樣本20，包括鄭州鯉（n=5）、泰安鯉（n=5）、北京鯉（n=5），河北鯉（n=5）。其他鯉樣本20 個。

利用GeneJET Genomic DNA 純化試劑盒（Thermo Scientific,#k0721）提取采集的魚肉組織基因組DNA。提取后的樣品，首先用NanoDrop 2 000 c 分光光度計（Thermo Scientific,USA）檢測，考察其濃度及純度。然后用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，電壓120 V，30～40 min，電泳結束后凝膠成像系統(tǒng)觀察提取片段的完整性。符合標準的樣品于-20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 SNP 的挑選

本研究采用兩種方法挑選SNP，一是基于Carpbase 數(shù)據(jù)庫（中國水產科學研究院生物技術研究中心），對已有SNP 標記進行挑選，群體驗證后選擇位點；二是基于數(shù)量性狀基因，從已報道的與鯉體色、生長性狀相關的基因上搜索位點。

1.2.1 基于數(shù)據(jù)庫的挑選

通過Carpbase 數(shù)據(jù)庫檢索，依據(jù)以下三個標準挑選位點：（1）從鯉50 條染色體中挑選，根據(jù)每條染色體長度挑選1～4 個位點，且位點間距離大于8 Mb；（2）所選位點位于染色體非編碼區(qū)；（3）最小等位基因頻率（MAF）大于30%。共獲得候選位點54個。針對挑選的54 個位點設計多重引物，利用多重PCR 反應擴增模板，產物純化后利用二代測序平臺（Illumina X-10 高通量基因分型平臺）進行測定。二代測序由上海翼和應用生物技術有限公司提供技術支持（http://www.biowing.com.cn/）。用于數(shù)據(jù)庫位點驗證的鯉樣本共計6 個品種、170 個樣本，包括黃河鯉（n=70）、荷包紅鯉（n=20）、福瑞鯉（n=20）、松浦鏡鯉（n=20）、建鯉（n=20）和豐鯉（n=20）。54 個位點多重測序引物見表1。PCR 擴增體系共12 μL，其中：ddH2O 2 μL，Mix 6 μL，1 μM Primer 2 μL，DNA Sample 1.8 μL，ROS 0.24 μL。PCR 擴增反應條件：95℃160 min，然后94℃30 sec，60℃30 sec，72℃30 sec，共35 個循環(huán)，最后4℃∞。

表1 54 個SNP 位點測序引物Tab.1 Primer information of the 54 SNP markers

多重PCR 產物純化后，使用Agilent 2100 對產物進行質控。

1.2.2 基于性狀基因的挑選

通過NCBI 和Carpbase 數(shù)據(jù)庫檢索及文獻報道，選擇了與鯉體色、生長性狀、肉質性狀相關的53個基因[21-23]（表2）。上述53 個性狀基因，每個基因選取1～5 個基因片段，考察各基因片段同源性，去除高同源，最終得到111 個可用待測片段。目標區(qū)域重測序結合多重PCR 技術和高通量測序技術，對待測片段設計多重PCR 引物。PCR 擴增體系和擴增程序同1.2.1。用于測序的樣本共計130 個，包括黃河鯉（n=30）、荷包紅鯉（n=20）、福瑞鯉（n=20）、鏡鯉（n=20）、建鯉（n=20）和豐鯉（n=20）。高通量測序由上海翼和應用生物技術有限公司提供技術支持。測序結果通過SepMAN 軟件比對多樣本相同擴增序列，獲得目標樣本候選多態(tài)性位點，圖1 為某個多態(tài)性位點高通量測序散點圖。由圖1 可知，該位點在鯉測試群體中基本不發(fā)生突變，主要以“T”的純合子形式存在。

圖1 高通量測序結果Fig.1 High-throughput sequencing results

表2 性狀基因所在染色體及其他相關信息Tab.2 Chromosome location of trait genes and other relevant information

1.3 統(tǒng)計分析

通過直接計數(shù)方式獲得各位點在樣品群體中的等位基因頻率、基因型頻率[24]。根據(jù)公式計算耦合概率（matching probability,MP）[25]。

式中，m-位點數(shù)；n-位點k 等位基因數(shù)；Pki(j)-位點k 等位基因i、j 等位基因頻率。

2 結果與討論

2.1 位點篩選結果

通過兩種方式獲得的多態(tài)性位點，還需進一步挑選以滿足黃河鯉鑒定的需要。挑選標準如下：（1）位點在黃河鯉（或普通鯉）中多態(tài)性較高，兼具兩種純合子和一種雜合子，位點在普通鯉（或黃河鯉）中多態(tài)性低，只具有一種純合子；（2）位點在多態(tài)性較高的鯉品種中MAF 大于0.3，在多態(tài)性較低的品種中MAF 小于0.05。

按照以上挑選標準，共得到候選位點27 個。27個位點所在染色體及基因等信息見表3，位點在各鯉群體中的等位基因頻率見表4。

表3 27個SNP 位點所在染色體位置信息Tab.3 Chromosomal location information of 27 SNP sites

2.2 黃河鯉的鑒定效果評估

27 個位點對黃河鯉與不同品種普通鯉的區(qū)分能力存在差異（表4）。為提高標記組特異性,提高鑒別效率，按照區(qū)分能力對位點進行排序，選擇區(qū)分能力較好的12 個標記，用于黃河鯉與普通鯉品種的鑒別（表5）。黃河鯉被錯誤鑒定為普通鯉的概率用MP 值表示（圖2）。

表4 27 個SNP 標記在各品種中等位基因頻率Tab.4 The allele frequencie of 27 SNPs in each variety

由表5 和圖2 可知，只需1～3 個標記就可實現(xiàn)黃河鯉與其中一個普通鯉品種的鑒別，而豐鯉與黃河鯉的鑒別只需1 個特異性標記即可。使用12 個SNP 位點組合，黃河鯉與各品種普通鯉鑒別效果較好，MP 值均小于6×10-5。其中，黃河鯉與松浦鏡鯉、豐產鯉的鑒別效果最好，MP 值均接近于0；黃河鯉與荷包紅鯉、福瑞鯉、建鯉的鑒別效果較好，MP 值在1×10-5～6×10-4之間。12 個SNP 位點組合特異性較高，理論上可以滿足黃河鯉在80%鯉主產區(qū)的鑒別要求。進一步利用二代測序技術對40 個驗證樣本12 個SNP 位點進行分型，依據(jù)分型結果對樣本進行鑒別（表6）。

表5 12 個SNP 標記位點信息Tab.5 Information of the twelve SNP loci

表6 40 個樣本鑒別結果Tab.6 Identification results of 40 samples

圖2 黃河鯉與普通鯉MP 值Fig.2 MP values of Yellow River carp and common carp

由表6 可知，鄭州鯉全部鑒別為黃河鯉；泰安鯉、北京鯉以及河北鯉有少部分樣本并非黃河鯉，而是福瑞鯉和建鯉；其他鯉樣本僅有一個為黃河鯉，其余樣本均為福瑞鯉。值得注意的是，40 個驗證樣本有一半為福瑞鯉，黃河鯉銷售市場存在大量福瑞鯉的主要原因有以下兩點：（1）福瑞鯉為野生黃河鯉和建鯉雜交選育的新品種，具有黃河鯉部分優(yōu)良性狀，與黃河鯉極為相似，深受養(yǎng)殖戶和消費者的喜愛；（2）福瑞鯉為我國鯉主產區(qū)六大鯉養(yǎng)殖品種之一，具有養(yǎng)殖范圍廣、產量大的特點。

3 結論

本研究通過數(shù)據(jù)庫挑選和性狀基因搜索，共得到27 個SNP 候選位點。理論上只需12 個標記位點組合，就可滿足黃河鯉在我國80%以上鯉主產區(qū)的鑒定，黃河鯉鑒定錯誤率小于6×10-5。利用標記組合對40 個驗證樣本進行鑒定，以黃河鯉之名銷售的20 個樣本，只有鄭州鯉全部為黃河鯉，其他20個鯉樣本多為福瑞鯉。在實際應用中，還可根據(jù)所處省份的不同，按照當?shù)鼐唧w情況對位點進行選擇，這樣可大幅降低標記的數(shù)量，提高鑒別效率。在應用方面，可以考慮將等位特異性PCR 分型與毛細管電泳結合[26]，實現(xiàn)SNP 位點快速分型，這有助于在中小企業(yè)應用推廣黃河鯉SNP 溯源，有利于黃河鯉的市場銷售，保障消費者的合法權益[27]。