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        蒲參膠囊對心肌梗死動物模型心室重構和心室舒縮功能的影響

        2022-06-30 09:01:50朵杰白潔韓瓊
        河北醫(yī)藥 2022年12期
        關鍵詞:射血心室左心室

        朵杰 白潔 韓瓊

        心室重構是心肌梗死(myocardial infarction,MI)引起的心功能減退的常見原因,心肌組織的損傷和異常增生會直接影響心臟的收縮能力和射血功能[1]。而心臟纖維化則是導致心室重構最主要因素,研究顯示MI后會引起氧化應激反應,導致轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)表達的身高,進而會激活Smad蛋白,從而調(diào)控細胞增殖和分化,并促進心臟纖維化引起心室重構[2,3]。但是目前尚無有效的提高MI后心功能和緩解心室重構的特效藥物。蒲參膠囊是一種中藥復方制劑,具有改善微循環(huán)、保護心肌缺血/再灌注損傷等有益效果[4]??偵?,本研究主要分析蒲參膠囊對MI后心室重構和射血功能的影響,并分析其對TGF-β1/Smad通路的影響。

        1 材料與方法

        1.1 材料 Sprague-Dawley(SD)大鼠(SPF級,雄性,8~10周,270~290 g)45只。HP SONOS 5500 型的超聲心動圖儀(飛利浦公司,美國)。蒲參膠囊(Z20040074,蘇中藥業(yè),中國)。HE染色試劑盒購自武漢華美公司(中國)。顯微鏡(Olympus 公司,日本)。ELISA染色試劑盒(碧云天公司,中國)。酶標儀(Model 680,Bio-Rad,美國)。RNAspin Mini試劑盒(GE Healthcare,美國)。BestarTMqPCR試劑盒(DBI Bioscience公司,德國)。抗體、一抗和山羊抗免疫球蛋白G(IgG)二抗(1∶1 000稀釋,#ab6721)(Abcam公司,美國)。聚偏二氟乙烯膜(EMD Millipore,美國)。ECL 顯色試劑盒(Thermo Fisher公司,美國)。

        1.2 分組、建模與干預 45只大鼠隨機分為對照組、MI組和MI+蒲參膠囊組(n=15)。根據(jù)參考文獻建立MI大鼠模型[5],將MI組和MI+蒲參膠囊組的大鼠連接心電圖,麻醉(4%水合氯醛)后連接心電圖,后迅速打開胸小心撕開心包腔暴露心臟,利用5-0號縫合線結扎冠脈降支,但不需要結扎很近,心電圖ST段升高至>0.5 mV即可。然后,將心臟迅速放回胸腔內(nèi),簡單縫合胸腔,腹腔注射8×105U的青霉素預防感染。對照組大鼠僅暴露心臟相同時間但不結扎。MI+蒲參膠囊組大鼠在建模后通過蒲參膠囊灌胃處理,劑量為40 mg/kg[6],1次/d,連續(xù)4周。

        1.3 方法

        1.3.1 心功能檢測:通過HP SONOS 5500 超聲心動圖儀的雙通道左心室射血分數(shù)(LVEF)和左心室短軸縮短率(LVFS),從而評估心室射血功能和收縮功能。

        1.3.2 心室重構情況:吸入過量二氧化碳安樂死大鼠,測量體重(g);取出心臟組織并稱重(mg);然后分理處心室組織并稱重(mg)。通過檢測心臟和心室組織與體質(zhì)量的比值(mg/g)作為心臟指數(shù)和心室指數(shù),從而分析心室重構情況。

        1.3.3 HE染色:HE染色檢測大鼠左心室心肌組織的病理變化。心肌組織組織用10%甲醛溶液固定48 h,流水沖洗。不同濃度的乙醇脫水,然后將組織浸入蠟中,并切成 4~7 μm 的厚度。將載玻片置于 65℃恒溫烘箱中 30 min。脫蠟切片用不同濃度乙醇浸泡5 min,自來水沖洗10 min。然后將切片分別用伊紅溶液染色1~2 min。細胞核用蘇木精染色5 min。染色切片用純酒精脫水并在光學顯微鏡下檢查。

        1.3.4 RT-qPCR:使用RNeasy Mini試劑盒取將左心室心肌組織中的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,條件如下:37℃/15 min;98℃/5 min。然后使用BestarTMqPCR預混液進行qPCR實驗,條件如下:95℃/2 min, 94℃/20 s,58℃ 20 s,72℃/20 s,40個循環(huán),最后在72℃下延伸4 min。使用Agilent Stratagene Mx3000P序列檢測系統(tǒng)進行RT-qPCR分析。通過比較循環(huán)閾值并以GAPDH作為內(nèi)參計算TGF-β1和Smad mRNA相對表達水平。

        1.3.5 Western blot檢測蛋白:將左心室心肌組織織用勻漿機均勻研磨萃取總蛋白,通過BCA試劑盒測量濃度。每組取40 μg的總蛋白使用SDS-PAGE分離(10%,80~120 V,90 min)。在100 mV的恒定電壓下與PVDF膜進行濕轉(zhuǎn)移。在5%牛血清白蛋白(BSA)中于室溫孵育1 h。將1∶500稀釋的TGF-β1和Smad一抗添加膜中(4℃,12 h)。洗滌后在加入1∶2 000稀釋的二抗孵育室溫下1 h。利用化學發(fā)光試劑盒顯色。用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

        2 結果

        2.1 蒲參膠囊對MI大鼠心功能的影響 3組大鼠的左心室舒縮功能比較差異顯著(P<0.05)。MI組LVE和LVFS顯著低于對照組(P<0.05),MI+蒲參膠囊組心臟指數(shù)LVEF和LVFS顯著高于MI組(P<0.05)。見表1。

        表1 蒲參膠囊對MI大鼠心功能的影響

        2.2 蒲參膠囊對MI大鼠心室重構的影響 3組大鼠的心臟指數(shù)和心室指數(shù)比較差異顯著(P<0.05)。MI組心臟指數(shù)[(3.94±0.42)mg/g]和心室指數(shù)[(2.38±0.25)mg/g]顯著高于對照組(P<0.05),MI+蒲參膠囊組心臟指數(shù)[(2.86±0.31)mg/g]和心室指數(shù)[(1.56±0.16)mg/g]顯著低于MI組(P<0.05)。見表2。

        表2 蒲參膠囊對MI大鼠心臟指數(shù)和心室指數(shù)的影響

        2.3 蒲參膠囊對MI大鼠左心室心肌組織損傷的影響 對照組細胞核染色清晰,細胞質(zhì)染色均勻,細胞排列有序。MI組細胞核染色變深或變淺,心肌細胞染色變淺,形狀發(fā)生改變,排列紊亂,并且細胞外基質(zhì)大量增生。MI+蒲參膠囊組組細胞排列異常和損傷情況均較輕。見圖1。

        圖1 蒲參膠囊對MI大鼠左心室心肌組織損傷的影響(HE染色×400)

        2.4 蒲參膠囊對MI大鼠TGF-β1和Smad mRNA表達水平的影響 3組大鼠左心室心肌組織中TGF-β1和Smad mRNA表達水平比較差異顯著(P<0.05)。MI組的TGF-β1和Smad mRNA水平顯著高于對照組(P<0.05),MI+蒲參膠囊組的TGF-β1和Smad mRNA水平顯著低于MI組(P<0.05)。見表3。

        表3 蒲參膠囊對MI大鼠TGF-β1和Smad mRNA表達水平的影響

        2.5 蒲參膠囊對MI大鼠TGF-β1和Smad蛋白表達水平的影響 3組大鼠左心室心肌組織中TGF-β1和Smad蛋白表達水平比較差異顯著(P<0.05)。MI組的TGF-β1和Smad蛋白水平顯著高于對照組(P<0.05),MI+蒲參膠囊組的TGF-β1和Smad蛋白水平顯著低于MI組(P<0.05)。見圖2,表4。

        圖2 Western blot檢測蒲參膠囊對MI大鼠TGF-β1和Smad蛋白表達水平的影響

        表4 蒲參膠囊對MI大鼠TGF-β1和Smad蛋白表達水平的影響

        3 討論

        每年約有1 730萬的患者死于心血管疾病,是公共衛(wèi)生系統(tǒng)面臨的重大挑戰(zhàn)[7]。心肌梗死是最常見的心血管疾病之一,會導致心室功能障礙、耗氧量增加和心肌細胞的凋亡,并且出現(xiàn)膠原纖維增生,最終引起心室重構和心肌纖維化[8]。

        蒲參膠囊是一種由何首烏、蒲黃、丹參、川芎、赤芍、山楂、澤瀉組成的膠囊劑,其具有活血祛淤,滋陰化濁之功效[9]?,F(xiàn)階段,臨床上蒲參膠囊重要用于治療高血脂引起的心腦血管病變,或者用于減輕腦梗死相關疾病[10,11]。如一項臨床研究顯示蒲參膠囊可通過保護血管緩解輕度認知障礙[11]。MI過程與腦梗死相似,為研究蒲參膠囊對MI的影響,本研究通過栓線法構建MI大鼠模型,并通過蒲參膠囊灌胃干預4周。結果顯示MI模型大鼠的LVEF和LVFS降低,說明左心室射血功能和舒縮功能異常,并且心臟指數(shù)和心肌指數(shù)升高,提示出現(xiàn)心肌增生重構。蒲參膠囊能夠顯著恢復MI大鼠的心功能,并減少左心室心肌組織損傷和心室重構。MI過程會導致大量活性氧自由基的生成,從而誘發(fā)細胞內(nèi)的炎性反應,有研究顯示蒲參膠囊可緩解心肌缺血再灌注損傷抑制炎性反應。結合文獻報道和本次研究結果,說明蒲參膠囊能夠緩解MI大鼠的心肌損傷,并抑制心室重構,保護心室舒縮功能從而改善心臟的射血功能。

        本研究檢測了蒲參膠囊對MI大鼠左心室心肌組織中TGF-β1/Smad通路轉(zhuǎn)錄和蛋白表達水平的影響。如前所述,MI后誘發(fā)的氧化應激、炎性反應、免疫反應等均會引起心肌組織的纖維化,從而導致心室重構并導致心肌組織失去彈性影響射血功能[12]。TGF-β1是纖維化最關鍵因子之一,其高表達會激活Smad的轉(zhuǎn)錄功能,從而促進膠原蛋白或者細胞外基質(zhì)蛋白的轉(zhuǎn)錄和翻譯,導致心臟纖維化[13]。并且抑制TGF-β1/Smad可顯著的抑制纖維化保護心功能[14]。本次研究結果顯示MI模型大鼠左心室心肌組織中TGF-β1、Smad mRNA和蛋白水平顯著升高,而蒲參膠囊抑制則可顯著的抑制TGF-β1和Smad的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達。劉永萍等[15]研究顯示蒲參膠囊可顯著抑制TGF-β1的表達,從而保護動脈粥樣硬化患者的血管功能。結合文獻報道和本次研究結果,提示蒲參膠囊可能通過抑制TGF-β1/Smad通路緩解心肌損傷和心室重構,從而保護心室的射血功能。

        綜上所述,蒲參膠囊可能緩解MI大鼠心室重構改善心室的射血功能,并抑制TGF-β1/Smad通路。本研究結果提示蒲參膠囊可有效的保護MI后的心臟功能,可能成為治療MI的新方法。

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