劉彩茹 馮海芹 王玉紅 張麗娜 楊麗萍

宮頸癌是繼乳腺癌之后第二大最常見的女性癌癥，嚴(yán)重影響著全世界女性的健康特別是在發(fā)展中國家[1]。宮頸癌由某些癌基因和抑癌基因的異常表達(dá)引起，盡管由于HPV疫苗的使用已大大降低了宮頸癌的發(fā)病率，但宮頸癌仍是全世界癌癥相關(guān)死亡的第三大誘因[2]。目前雖然在宮頸癌的治療技術(shù)取得了較大的進(jìn)步，但宮頸癌患者的5年總生存率仍然只保持在60%～70%，且在近40年中沒有顯著下降[3]。宮頸癌在早期診斷方面取得了巨大的進(jìn)步，但是晚期宮頸癌患者的預(yù)后仍然很差[4]。常規(guī)上，化學(xué)療法，放射療法和外科手術(shù)是所有患者的常用療法，但是，這些常規(guī)療法中的大多數(shù)對患者具有嚴(yán)重的不良影響[5]。替代藥物已成為一種潛在的治療方法，具有較少的不良反應(yīng)和更實(shí)惠的成本[6]，尤其是抗癌藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)的主要來源[7]。Elk1是一種轉(zhuǎn)錄激活因子，可調(diào)節(jié)涉及增殖和轉(zhuǎn)移的多種基因，例如原癌基因c-fos等轉(zhuǎn)錄復(fù)合體[8]。研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)，ELK1在多種癌癥(如膀胱癌)中起癌基因的作用[9]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)沙利度胺和順鉑對宮頸癌細(xì)胞具有抑制作用，但是對沙利度胺聯(lián)合順鉑對Elk1轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)和活性在宮頸癌細(xì)胞中的研究較少，且Elk1可能是藥物治療的一個(gè)重要靶點(diǎn)，因此研究宮頸癌的診斷生物標(biāo)志物和治療策略具有重要的意義。本實(shí)驗(yàn)研究沙利度胺聯(lián)合順鉑對宮頸癌Hela細(xì)胞Elk1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子活性的影響，以及其聯(lián)合作用對宮頸癌細(xì)胞增殖的抑制作用，并試圖從機(jī)制上闡明沙利度胺聯(lián)合順鉑對宮頸癌細(xì)胞的治療作用。

1 材料與方法

1.1 材料 HeLa宮頸癌細(xì)胞獲自河北醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院科研中心細(xì)胞庫，順鉑購自齊魯制藥有限公司(中國)，沙度利胺購自江蘇常州制藥廠(中國)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和處理 將細(xì)胞在含有10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基中于37℃在含有5%CO2的潮濕氣氛中培養(yǎng)。將培養(yǎng)的細(xì)胞隨機(jī)分成4組，分別為對照組(CK)-正常培養(yǎng)，不加任何處理；沙利度胺組(Thal)-用400 mg/L沙利度胺處理；順鉑組(PDD)-用1 mg/L順鉑處理和沙利度胺聯(lián)合順鉑組(Thal+PDD)，每組3個(gè)重復(fù)，并24 h后進(jìn)行觀察和檢測。

1.3 細(xì)胞凋亡檢測與免疫組織化學(xué)(IHC)分析 細(xì)胞凋亡通過FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)測量。將收集細(xì)胞并將其重懸于膜聯(lián)蛋白V結(jié)合緩沖液(5×106/ml)中，然后在黑暗中將細(xì)胞與Annexin V/FITC混合5 min。之后向細(xì)胞溶液中加入10 μl PI染料和400 μl PBS，進(jìn)行流式細(xì)胞儀進(jìn)行凋亡分析。石蠟包埋切成4 μm的切片，在與抗ALK1或抗Ki67孵育之前(20 min，1∶500)進(jìn)行去石蠟，補(bǔ)液和抗原回收(微波，30 min)。接下來通過使用DAB方法顯影切片，用蘇木精染色2次，用梯度乙醇脫水，并用中性樹脂固定后，觀察組織切片并在顯微鏡的5個(gè)隨機(jī)視野中成像。

1.4 熒光素酶活性檢測 使用FLUROStar熒光檢測儀：取出96孔板室溫融化，每孔取30 μl移入96孔熒光板，使用能夠自動加樣的FLUROStar檢測熒光素酶活性。先加入螢火蟲(Firefly)熒光素酶底物25 μl/孔，檢測螢火蟲熒光素酶活性，再加入終止液和海腎(Renilla)熒光素酶底物25 μl/孔，檢測內(nèi)對照海腎熒光素酶活性。

1.5 RNA提取和RT-PCR 使用TRIzol試劑(Invitrogen，CA，USA)提取細(xì)胞系的總RNA，然后使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara，Otsu，Shiga，Japan)合成cDNA。通過使用FTC-3000實(shí)時(shí)定量熱循環(huán)儀(Funglyn Biotech Inc.，上海)測量mRNA表達(dá)。引物序列如下：ELK1，5’-GGC TAC GCA AGA ACA AGACCAAC-3’(正向)和5’-AGA CGA ACT TCT GGC CGC TCA-3’(反向)；c-fos，5’-CCACCTTCACCATCCAGTCT-3’(正向)和5’-TCTTCCGATTTCAGGTTTGG-3’ (反向)；caspase-8，5’-TCTTCCCTGGCTTGGC-3’(正向)，5’-TG

GGCTCTTTCGT GGC-3’(反向)，caspase-9，5’-CTCCA

GCTCACACAACTCCA-3’ (正向)，5’-TGTTTCAGCTG

TGCCACTTC-3’ (反向)；GAPDH，5’-GTCAACGGATT

TGGTCTGTATT-3’(正向)和5’-AGTCTTCTGGGTGGC

AGTGAT-3’(反向)。所有mRNA表達(dá)均以GAPDH做內(nèi)參并用 2-ΔΔCt法計(jì)算基因表達(dá)定量。

1.6 Western Blot 處理后，使用放射免疫沉淀分析(RIPA)緩沖液(Shenneng Bocai)提取細(xì)胞的總蛋白。使用雙辛可寧酸(BCA)方法測量蛋白質(zhì)濃度。然后使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離20 mg蛋白質(zhì)。用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行免疫檢測，ELK1、c-fos、caspase-8、caspase-9和3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)的抗體購自Cell Signaling Technology(荷蘭萊頓)。通過化學(xué)發(fā)光(ECL)開發(fā)系統(tǒng)可視化的蛋白條帶。用ImageJ軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)密度的定量。

2 結(jié)果

2.1 藥物處理后對Hela細(xì)胞增殖的影響 與對照組比較，沙利度胺組和順鉑組宮頸癌細(xì)胞增殖抑制率顯著升高(P<0.05)；與沙利度胺組和順鉑組比較，聯(lián)合組宮頸癌細(xì)胞增殖抑制率顯著升高。見表1。

表1 4組藥物處理后對Hela細(xì)胞增殖的影響

2.2 沙利度胺聯(lián)合順鉑對宮頸癌細(xì)胞Elk1表達(dá)和活性的影響 與對照組比較，沙利度胺組和順鉑組Elk1的mRNA相對表達(dá)水平和Elk1轉(zhuǎn)錄因子活性均顯著下降(P<0.05)；與與沙利度胺組和順鉑組比較，聯(lián)合組宮頸癌細(xì)胞中Elk1的mRNA相對表達(dá)水平和Elk1轉(zhuǎn)錄因子活性均顯著下降(P<0.05)。見表2。

表2 沙利度胺和順鉑處理后Hela細(xì)胞中Elk1的mRNA表達(dá)和Elk1熒光酶活性檢測

2.3 宮頸癌細(xì)胞中c-fos和caspase-8基因的表達(dá) 與對照組比較，沙利度胺組和順鉑組宮頸癌細(xì)胞中c-fos的mRNA相對表達(dá)水平顯著下調(diào)，caspase-8的mRNA相對表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05)；與沙利度胺組和順鉑組比較，聯(lián)合組宮頸癌細(xì)胞中c-fos的mRNA相對表達(dá)水平顯著下調(diào)，caspase-8的mRNA相對表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05)。見表3。

表3 沙利度胺和順鉑處理后Hela細(xì)胞中c-fos和caspase-8基因的相對表達(dá)水平

2.4 Elk1和c-fos蛋白在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá) 與對照組比較，沙利度胺組和順鉑組宮頸癌細(xì)胞中Elk1和c-fos蛋白的相對表達(dá)水平均顯著下調(diào)(P<0.05)；與沙利度胺組和順鉑組比較，聯(lián)合組宮頸癌細(xì)胞中Elk1和c-fos蛋白的相對表達(dá)水平均顯著下調(diào)(P<0.05)。見表4，圖1。

表4 沙利度胺和順鉑處理后Hela細(xì)胞中Elk1和c-fos蛋白的相對表達(dá)水平

圖1 沙利度胺和順鉑處理后Hela細(xì)胞中Elk1和c-fos蛋白的相對表達(dá)水平

2.5 沙利度胺聯(lián)合順鉑對宮頸癌細(xì)胞caspase-8蛋白表達(dá)影響 結(jié)果顯示，與對照組相比，沙利度胺組和順鉑組宮頸癌細(xì)胞中caspase-8蛋白的相對表達(dá)水平均顯著上調(diào)(P<0.05)；與沙利度胺組和順鉑組比較，聯(lián)合組宮頸癌細(xì)胞中caspase-8蛋白的相對表達(dá)水平均顯著上調(diào)(P<0.05)。見表4，圖2。

圖2 沙利度胺和順鉑處理后Hela細(xì)胞中Caspase-8蛋白相對表達(dá)水平

3 討論

宮頸癌是女性所有癌癥死亡的最常見原因之一，特別是在發(fā)展中國家[10]。像大多數(shù)癌癥一樣，宮頸癌在疾病的早期發(fā)展過程中沒有任何跡象[11]。但是，通常在腫瘤引起陰道分泌物和出血時(shí)出現(xiàn)癥狀，轉(zhuǎn)移患者也可能出現(xiàn)其他癥狀，包括疼痛或腰酸[12]。因此，大多數(shù)注意到癥狀的患者通常在腫瘤發(fā)展的后期階段。盡管診斷出患有早期宮頸癌的女性的5年總生存率超過90%[13]，但宮頸癌目前是全球女性中第四大最常見的癌癥[14]。

ELK1是各種類型的癌癥中ETS癌基因家族的成員，是ETS轉(zhuǎn)錄因子之一，其功能是利用保守的ETS DNA結(jié)合域來介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子[15]。ELK1在ETR的反式激活域中被多磷酸化，從而將其轉(zhuǎn)化為有效的轉(zhuǎn)錄激活因子，屬于成紅細(xì)胞轉(zhuǎn)化特異性(Ets)結(jié)構(gòu)域蛋白的亞家族，通過富嘌呤的GGA核心序列與DNA特異性序列結(jié)合，ELK1調(diào)節(jié)包括原癌基因在內(nèi)的多種基因的表達(dá)[16]。當(dāng)ELK1被磷酸化時(shí)，它易位至細(xì)胞核并激活下游靶標(biāo)，成為激活因子[17]。細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶/MAPK信號通路在許多生物學(xué)過程中起著重要作用，并且在包括癌癥在內(nèi)的幾種疾病狀態(tài)中經(jīng)常被調(diào)節(jié)[18]。MAPK信號主要通過激活包括ELK1在內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子來促進(jìn)基因表達(dá)[19]。

激活的ELK1與ELK1元件結(jié)合以調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)，先前的研究表明，ELK1介導(dǎo)的靶基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)與肌動蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)和細(xì)胞遷移有關(guān)。該網(wǎng)絡(luò)中重要的ELK1靶基因部分控制著細(xì)胞骨架相關(guān)的活動，包括細(xì)胞遷移[20]。與先前的研究一致，本研究的結(jié)果表明，沙利度聯(lián)合順鉑引起的ELK1轉(zhuǎn)錄活性的降低，以及靶基因c-fos基因和蛋白表達(dá)的下調(diào)可能是抑制宮頸細(xì)胞系中細(xì)胞增殖的原因。此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)ELK1在宮頸癌組織中顯著上調(diào)[21]。相似的，在本研究中也驗(yàn)證了ELK1在宮頸癌組織中的表達(dá)明顯上調(diào)。沙利度與順鉑的聯(lián)合使用可降低宮頸癌細(xì)胞中ELK1的熒光素酶活性和蛋白表達(dá)，表明ELK1可能是這種藥物的靶基因，從而起到抑制細(xì)胞增殖，遷移和侵襲的作用。本研究的結(jié)果表明，與沙利度和順鉑單獨(dú)處理相比，聯(lián)合使用后使宮頸癌細(xì)胞中ELK1和c-fos的表達(dá)水平降低，并且抑制細(xì)胞增殖和侵襲。因此，在宮頸癌中鑒定ELK1可能有助于了解潛在的腫瘤發(fā)生分子機(jī)制，并為宮頸癌的治療提供新的預(yù)后標(biāo)記。

本研究中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ELK1是沙利度聯(lián)合順鉑的直接靶標(biāo)，其可以降低宮頸癌細(xì)胞中ELK1的表達(dá)和活性，通過RT-PCR檢測了磷酸化的Elk1靶基因c-fos及膜受體通路基因caspase-8的表達(dá)及對人宮頸癌細(xì)胞的作用。結(jié)果表明，Elk1靶基因c-fos在Hela細(xì)胞內(nèi)被顯著下調(diào)，膜受體通路基因caspase-8基因顯著上調(diào)，因此說明沙利度聯(lián)合順鉑可抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，這為進(jìn)一步研究ELK1轉(zhuǎn)錄因子和宮頸癌的治療方法提供了一些理論依據(jù)和參考。