楊學(xué)軍 全信保 王強

胃癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率呈增長趨勢，嚴(yán)重威脅人類生命健康[1]。由于胃癌發(fā)病隱匿，早期缺乏典型的臨床特征，多數(shù)患者確診時已處于中晚期[2]。目前，胃癌的治療缺乏有效方法，尋找并研發(fā)用于治療胃癌的藥物尤為重要。紅樹莓俗稱覆盆子、托盤等，其營養(yǎng)物質(zhì)豐富，被譽為“黃金水果”。紅樹莓富含原花青素、酚酸類、黃酮類和三萜等多種活性物質(zhì)，具有抗動脈粥樣硬化、降血脂、抗氧化等活性[3-5]。研究顯示，紅樹莓提取物可降低肝癌SMMC-7721細胞的增殖能力，其作用機制與AKT通路調(diào)控的cyclinA-CDK2介導(dǎo)的S期阻滯有關(guān)[6]。但目前，紅樹莓提取物能否影響胃癌細胞的惡性表型還未知。微小RNA(miRNA)是一類小分子非編碼RNA，其參與調(diào)控腫瘤細胞的增殖、凋亡和遷移等惡性表型，可作為腫瘤治療的分子靶點[7]。有報道稱，miR-194-5p在胃癌組織和細胞系中表達下調(diào)，通過上調(diào)其表達可有效削弱胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，miR-194-5p有可能成為胃癌治療的分子靶點[8]。本研究以胃癌細胞AGS為研究對象，主要探討了紅樹莓提取物對AGS細胞增殖、遷移和侵襲的影響及其能否通過調(diào)控miR-194-5p發(fā)揮作用，以期為其用于胃癌的治療提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑 AGS細胞系，中國科學(xué)院上海細胞庫；胎牛血清(FBS)，杭州四季青；RPMI 1640培養(yǎng)基、細胞計數(shù)試劑盒-8(CCK-8)和二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒，北京索萊寶；LipofectamineTM 2000試劑盒，美國Invitrogen公司；miR-194-5p抑制劑(anti-miR-194-5p)、抑制劑陰性對照序列(anti-miR-NC)及PCR引物，上海吉瑪制藥技術(shù)；兔抗人基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)、磷酸化磷脂酞肌醇3-激酶(p-PI3K)和磷酸化的蛋白激酶B(p-Akt)抗體，美國Santa Cruz公司；RNA抽提試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒，大連寶生物。

1.2 方法

1.2.1 紅樹莓提取物制備:紅梅提取物的制備參照文獻方法[9]：準(zhǔn)確稱取100 g紅樹莓樣品，加300 ml 80%預(yù)冷乙醇，用乳化勻漿器攪拌提取4 h。離心15 min(3 500 r/min)后，將濾液真空旋轉(zhuǎn)濃縮至約5～10 ml，冷凍干燥。準(zhǔn)確稱取一定量的干燥后產(chǎn)物，用磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解，配置濃度為0.5 g/ml的母液，4℃保存，使用時培養(yǎng)基稀釋。

1.2.2 AGS細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染:用含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)AGS細胞。取對數(shù)期AGS細胞，將其接種至6孔板中(2.5×105個/孔)。當(dāng)細胞生長密度達80%時，用LipofectamineTM 2000脂質(zhì)體法分別轉(zhuǎn)染anti-miR-NC、anti-miR-194-5p至AGS細胞。轉(zhuǎn)染12 h后，更換新鮮培養(yǎng)基，再培養(yǎng)24 h，RT-qPCR檢測細胞中miR-194-5p表達驗證轉(zhuǎn)染效果，并收集細胞備用。

1.2.3 細胞分組:未轉(zhuǎn)染的AGS細胞分為對照組(NC組)，不同濃度(20、40、80、160 mg/ml)紅樹莓提取物組，其中NC組細胞用常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)，不同濃度(20、40、80、160 mg/ml)紅樹莓提取物組細胞分別用含紅樹莓提取物終濃度為20、40、80、160 mg/ml的培養(yǎng)基干預(yù)。轉(zhuǎn)染anti-miR-NC、anti-miR-194-5p的AGS細胞用含紅樹莓提取物終濃度為80 μg/ml的培養(yǎng)基干預(yù)，記為80 mg/ml紅樹莓提取物+anti-miR-NC組、80 mg/ml紅樹莓提取物+anti-miR-194-5p組。

1.2.4 CCK-8檢測細胞增殖:取未轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染后的AGS細胞，均接種至96孔板中(2.5×104個/孔)，培養(yǎng)4 h后，棄培養(yǎng)基，按1.2.3分組處理。處理24 h后，加10 μl CCK-8，孵育2 h，用酶標(biāo)儀(λ=450 nm)檢測各孔吸光度(A)值。

1.2.5 Transwell法檢測細胞遷移和侵襲:取未轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染后的AGS細胞，均接種至6孔板中(2.5×105個/孔)，培養(yǎng)4 h后，棄培養(yǎng)基，按1.2.2分組處理。處理24 h后，收集各組細胞，并將其密度調(diào)整為5.0×104個/ml。細胞侵襲：將Transwell小室置于24孔板中，上室鋪Matrigel基質(zhì)膠，自然晾干后加100 μl細胞懸液。下室加500 μl培養(yǎng)基。培養(yǎng)4 h后，棄培養(yǎng)基，按1.2.2分組處理，處理24 h后，棄培養(yǎng)基，用多聚甲醛固定、結(jié)晶紫染色，顯微鏡觀察。隨機取5個視野，記數(shù)。遷移實驗無需鋪Matrigel基質(zhì)膠，剩余操作步驟與同侵襲實驗。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法實驗檢測MMP-2、MMP-9、p-PI3K和p-AKT蛋白表達:未轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染后的AGS細胞，均接種至6孔板中(2.5×105個/孔)，培養(yǎng)4 h后，棄培養(yǎng)基，按1.2.2分組處理。處理24 h后，用RIPA試劑提取細胞中總蛋白。經(jīng)BCA法定量后，行SDS-PAGE電泳。然后轉(zhuǎn)膜、封閉后，分別用MMP-2(1∶500)、MMP-9(1∶500)、p-PI3K(1∶1 000)、p-AKT(1∶1 000)和β-actin(1∶1 000)一抗孵育液在4℃冰箱中孵育過夜。洗膜后，用山羊抗兔二抗(1∶2 000)孵育液在37℃搖床中孵育1 h。加顯影液避光顯影，曝光拍照，Image J軟件分析MMP-2、MMP-9、p-PI3K、p-AKT相對于β-actin的表達量。

1.2.7 RT-qPCR實驗檢測miR-194-5p表達:取未轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染后的AGS細胞，均接種至6孔板中(2.5×105個/孔)，培養(yǎng)4 h后，棄培養(yǎng)基，按1.2.2分組處理。處理24 h后，用RNA提取試劑盒提取細胞中總RNA。經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后，行PCR擴增。擴增程序為95℃ 3 min，95℃ 10 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，共35個循環(huán)。引物序列：miR-194-5p上游5’-GCGGCGGTGTAACAGCAACT

CC-3’，下游5’-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3’；U6上游5’-GCTTCGGCACATATACTAAAAT-3’，下游5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。2-△△Ct法計算miR-194-5p相對于U6的表達量。

2 結(jié)果

2.1 紅樹莓提取物抑制胃癌細胞AGS增殖活性 與NC組比較，胃癌細胞AGS經(jīng)不同濃度(20、40、80、160 mg/ml)的紅樹莓提取物干預(yù)24 h后，細胞A值明顯降低(P<0.05)。見表1。

2.2 紅樹莓提取物抑制胃癌細胞AGS遷移和侵襲 與NC組比較，胃癌細胞AGS經(jīng)不同濃度(20、40、80、160 mg/ml)的紅樹莓提取物干預(yù)24 h后，細胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)明顯降低(P<0.05)，MMP-2、MMP-9蛋白表達明顯降低(P<0.05)。見圖1，表2。

表1 紅樹莓提取物對AGS細胞增殖活性的影響

圖1 Western Blot檢測MMP-2、MMP-9蛋白的表達

表2 紅樹莓提取物對AGS細胞遷移和侵襲的影響

2.3 紅樹莓提取物促進胃癌細胞AGS中miR-194-5p的表達 與NC組比較，胃癌細胞AGS經(jīng)不同濃度(20、40、80、160 mg/ml)的紅樹莓提取物干預(yù)24 h后，細胞中miR-194-5p的表達明顯升高(P<0.05)。見表3。

表3 紅樹莓提取物對AGS細胞中miR-194-5p表達的影響

2.4 敲減miR-194-5p可降低紅樹莓提取物對胃癌細胞AGS增殖、遷移和侵襲的影響 轉(zhuǎn)染anti-miR-194-5p的胃癌細胞AGS中miR-194-5p表達量明顯低于轉(zhuǎn)染anti-miR-NC的細胞(0.39±0.03、1.00±0.09，t=19.290，P<0.05)，表明敲減miR-194-5p的AGS細胞構(gòu)建成功。與轉(zhuǎn)染anti-miR-NC的AGS細胞比較，80 mg/ml的紅樹莓提取物作用的敲減miR-194-5p的AGS細胞A值升高(P<0.05)，遷移數(shù)和侵襲數(shù)升高(P<0.05)，MMP-2和MMP-9蛋白表達升高(P<0.05)。見表4，圖2。

表4 敲減miR-194-5p降低紅樹莓提取物對AGS細胞增殖、遷移和侵襲的影響

圖2 Western Blot檢測MMP-2、MMP-9蛋白的表達

2.5 紅樹莓提取物對胃癌細胞AGS中PI3K/AKT信號通路的影響 與NC組比較，胃癌細胞AGS經(jīng)80 mg/ml的紅樹莓提取物干預(yù)24 h后，細胞中p-PI3K和p-AKT蛋白表達明顯降低(P<0.05)。而與轉(zhuǎn)染anti-miR-NC的AGS細胞比較，80 mg/ml的紅樹莓提取物作用的敲減miR-194-5p的AGS細胞中p-PI3K和p-AKT蛋白表達明顯升高(P<0.05)。見圖3，表5。

圖3 Western Blot檢測p-PI3K、p-AKT蛋白表達

表5 PI3K/AKT信號通路蛋白表達情況

3 討論

我國是紅樹莓的多產(chǎn)國之一，但目前對紅樹莓的研究尤其是其在醫(yī)藥用品的應(yīng)用開發(fā)還不夠深入。近年來研究顯示，紅樹莓提取物具有抗腫瘤作用。有報道稱，紅樹莓提取物可能通過調(diào)節(jié)PTEN/AKT信號傳導(dǎo)途徑抑制肝細胞癌細胞增殖[10]。本研究結(jié)果顯示，胃癌細胞經(jīng)不同濃度(20、40、80、160 mg/ml)的紅樹莓提取物干預(yù)24 h后，細胞A值、遷移數(shù)和侵襲數(shù)均顯著降低，這表明紅樹莓提取物可抑制胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，具有一定抗胃癌作用。細胞遷移和侵襲受多種基因分子及信號通路的調(diào)控。MMP是一類可降解細胞外基質(zhì)的酶類，其中MMP-2和MMP-9是目前研究最多的影響腫瘤細胞遷移和侵襲的MMP。MMP-2和MMP-9可通過降解腫瘤細胞外基質(zhì)，促進腫瘤細胞遷移和侵襲[11]。本研究結(jié)果顯示，紅樹莓提取物可降低胃癌細胞中MMP-2和MMP-9的蛋白表達，提示其可能通過調(diào)控MMP-2和MMP-9來抑制胃癌細胞遷移和侵襲。

miRNA參與調(diào)控腫瘤細胞的惡性表型，為腫瘤治療提供了分子靶點。研究已表明，miR-125b-5p[12]、miR-362[13]和miR-106b-5p[14]等多種miRNA參與胃癌的發(fā)展進程，是胃癌治療的潛在分子靶點。研究顯示，膀胱癌[15]、透明細胞腎細胞癌[16]、神經(jīng)膠質(zhì)瘤[17]、喉癌[18]和肝細胞癌[19]等腫瘤中miR-194-5p表達明顯降低，miR-194-5p作為抑癌基因參與這些腫瘤的發(fā)展進程；而miR-194-5p在卵巢癌[20]和乳腺癌[21]中表達升高，促進腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲等，發(fā)揮促癌基因作用。Ding等[22]研究顯示，lncRNA TP73-AS1在胃癌組織和細胞系中表達上調(diào)，其通過靶向抑制miR-194-5p并上調(diào)SDAD1的表達來促進胃癌細胞生長和轉(zhuǎn)移，TP73-AS1/miR-194-5p/SDAD軸為胃癌的治療提供了潛在分子靶點。本研究結(jié)果顯示，紅樹莓提取物可有效促進胃癌細胞中miR-194-5p的表達，而敲減miR-194-5p降低紅樹莓提取物對胃癌細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用，提示紅樹莓提取物可能通過上調(diào)miR-194-5p表達來阻礙胃癌細胞增殖、遷移和侵襲。

PI3K/AKT信號通路是參與調(diào)控細胞增殖、凋亡等生命活動的重要通路，其在腫瘤中處于激活狀態(tài)，阻斷該通路可有效抑制腫瘤細胞的惡性表型[23]。近年來研究顯示，miRNA參與調(diào)控PI3K/AKT信號通路，進而影響腫瘤發(fā)展進程。例如，m2巨噬細胞源性外泌體miR-15a和miR-92a可通過調(diào)控PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞遷移和侵襲[24]；miR-15b通過抑制PI3K/AKT信號通路降低食道癌細胞的活力、遷移和侵襲，并促進食道癌細胞凋亡[25]；miR-489可通過靶向HDAC7阻斷PI3K/AKT途徑，進而抑制胃癌細胞增殖、遷移和侵襲[26]。本研究結(jié)果顯示，胃癌細胞經(jīng)80 mg/ml的紅樹莓提取物干預(yù)后，細胞中p-PI3K和p-AKT蛋白表達明顯降低，提示紅樹莓提取物可抑制胃癌細胞中PI3K/AKT信號通路的激活；而敲減miR-194-5p降低了紅樹莓提取物對胃癌細胞中PI3K/AKT信號通路的抑制作用，進一步提示紅樹莓提取物可能通過靶向miR-194-5p進而抑制PI3K/AKT信號通路來發(fā)揮抗胃癌作用。

綜上，一定劑量的紅樹莓提取物能夠削弱胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，其作用機制可能與上調(diào)細胞中miR-194-5p表達并阻礙PI3K/AKT信號通路的傳導(dǎo)有關(guān)，具有治療胃癌的潛在價值。但本研究僅通過體外細胞進行了初步探究，尚需要在體內(nèi)進一步驗證紅樹莓提取物的抗胃癌作用及具體的作用機制。