林 錕，吳逸希，曾 瓊

（1．汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科，廣東 汕頭 515041；2．汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東 汕頭 515041）

1型糖尿病（type 1 diabetes mellitus，T1DM）是對(duì)兒童青少年危害重大的自身免疫性疾病，其發(fā)病機(jī)制尚未十分清楚，亦缺乏早期血清學(xué)標(biāo)志物[1]。環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是一類特殊非編碼RNA分子，其分子屬封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu)，表達(dá)穩(wěn)定，不易降解[2]。這使得circRNA在作為新型臨床診斷標(biāo)記物的開發(fā)上具有明顯優(yōu)勢。這是一種新的、高度敏感的生物標(biāo)記物，具有很高的價(jià)值。研究發(fā)現(xiàn)circRNA參與了疾病的發(fā)生發(fā)展，包括自身免疫性疾病[3]。目前關(guān)于T1DM與circRNA的相關(guān)性研究較少。本研究假設(shè)circRNA通過多種基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制影響T1DM的發(fā)生發(fā)展，在胰島細(xì)胞損傷早期circRNA即出現(xiàn)差異表達(dá)，由于circRNA的高度穩(wěn)定性，異常表達(dá)的circRNA可在血液中被檢測出并作為未來T1DM一種新的、高度敏感的生物標(biāo)記物。本研究通過采用circRNA芯片檢測T1DM患者和正常人群外周血circRNA表達(dá)譜，采用生物信息學(xué)方法預(yù)測靶微RNA（micro RNA，miRNA），探討circRNA可能參與的T1DM分子機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2021年7—12月于汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科住院治療的T1DM患者3例，均符合T1DM診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)包括其他類型糖尿病、肝腎功能障礙、急性應(yīng)激狀態(tài)、惡性腫瘤、心腦血管疾患和妊娠患者。同時(shí)納入性別、年齡與T1DM患者匹配的健康對(duì)照者3名。本研究經(jīng)汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集 收集臨床資料、體格檢查并常規(guī)進(jìn)行血脂、空腹血糖、餐后2 h血糖、糖化血紅蛋白、血脂和肝腎功能檢測。

1.2.2 基因芯片檢測 空腹抽取靜脈血5 mL，放入乙二胺四乙酸，抗凝管顛倒混勻后，放于-80℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆茫徊捎肨rizol（美國Invitrogen公司）提取總RNA，其濃度、純度采用分光光度計(jì)測定，樣品合格后采用3′→5′核糖核酸外切酶消化線性RNA分子，互補(bǔ)DNA進(jìn)行擴(kuò)增、標(biāo)記（熒光），Agilent TapeStation系統(tǒng)進(jìn)行雜交、清洗，成像通過Axon基因芯片掃描儀呈現(xiàn)，circRNA差異表達(dá)譜采用GenePixPro 6.0軟件分析。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測 選擇差異倍數(shù)較大的circRNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）檢驗(yàn)?？俁NA反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA模板后使用qPCR儀（Applied Biosystems 7900）進(jìn)行擴(kuò)增，以U6作為內(nèi)參，circRNA的相對(duì)表達(dá)水平以計(jì)算。引物見表1。

表1 qPCR引物

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布計(jì)量資料以M（Q1，Q3）表示，組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料

T1DM組患者年齡和性別分別為男14歲，男21歲，女18歲，平均糖化血紅蛋白為12.82%。對(duì)照組為性別、年齡1∶1匹配入組，糖化血紅蛋白均小于6%。

2.2 芯片檢測結(jié)果

兩組患者外周血樣本circRNA芯片的篩選，上調(diào)共5 134個(gè)，下調(diào)共5 426個(gè)；69個(gè)circRNA差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，|logFC|＞1.5），其中64個(gè)上調(diào)，5個(gè)下調(diào)，見圖1。

圖1 1型糖尿病患者外周血環(huán)狀RNA差異表達(dá)

2.3qPCR驗(yàn)證

選取|log FC|改變更為明顯的5個(gè)circRNA通過qPCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，TIDM組與對(duì)照組相比hsa_circ_101079、 hsa_circ_100332、 hsa_circ_085129 及hsa_circ_103845表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.05），hsa_circ_006157在兩組間表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.48）。見圖2。

圖2 qPCR驗(yàn)證差異表達(dá)環(huán)形RNA

3 討論

近年來，非編碼RNA在表觀遺傳學(xué)的作用越來越受到重視。在所有非編碼RNA中，長鏈非編碼RNA和microRNA等早已被人熟知。而circRNA則是全新領(lǐng)域，與人類疾病的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關(guān)聯(lián)，是一種充滿前景的分子標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。circRNA在各種疾病發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用，包括癌癥、動(dòng)脈粥樣硬化、骨關(guān)節(jié)炎、肺纖維化、肌強(qiáng)直性營養(yǎng)不良和阿爾茨海默病[3]。在糖尿病領(lǐng)域，雖然circRNA的相關(guān)研究較少，但已有讓人欣喜的收獲。Stoll等[4]發(fā)現(xiàn)circRNA是細(xì)胞活動(dòng)的新調(diào)控因子，在糖尿病發(fā)生時(shí)參與了β細(xì)胞的功能失調(diào)。此外，circRNA cdr1as在胰島細(xì)胞功能和胰島素分泌中起著重要作用[5]。臨床研究方面，有研究通過微陣列分析比較了2型糖尿病患者和對(duì)照組受試者外周血中circRNA的表達(dá)情況，并在較大的獨(dú)立隊(duì)列中進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果提示hsa-circ-0054633是糖尿病前期和2型糖尿病診斷的生物標(biāo)志物[6]。

目前涉及T1DM的機(jī)制研究較欠缺。本研究通過circRNA芯片檢測T1DM患者和正常人群外周血circRNA表達(dá)譜，共篩選出4個(gè)目的circRNA，分別為hsa_circ_101079、hsa_circ_100332、hsa_circ_085129及hsa_circ_103845。qPCR驗(yàn)證結(jié)果表明，這4個(gè)circRNA可能成為T1DM和健康個(gè)體的新生物標(biāo)志物。本研究入組病例數(shù)雖較少，但診斷準(zhǔn)確度較高。我們的研究成果與Li等[7]的研究基本一致。和目的circRNA緊密結(jié)合的miRNA與正常免疫反應(yīng)和自身免疫疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)[8]。例如，hsa_circRNA_100332靶向結(jié)合的hsa-miR-892a在從潛伏性結(jié)核向活動(dòng)性結(jié)核的炎癥轉(zhuǎn)變期間在CD4+T細(xì)胞中下調(diào)[9]。hsa_circRNA_085129靶向的hsa-miR-145-5p通過抑制炎癥因子的分泌改善巨噬細(xì)胞的炎癥狀態(tài)[10]，被認(rèn)為是多發(fā)性硬化癥的生物標(biāo)志物[11]。hsa_circRNA_103845靶向的hsa-miR-127-3p屬胰島特異性miRNA，與胰島素生物合成和分泌密切相關(guān)，其能被脂多糖下調(diào)，可能參與脂多糖觸發(fā)的T1DM發(fā)展[12]。因此，我們觀察到的所有上游circRNA的上調(diào)預(yù)示著一種促炎癥狀態(tài)，這可能是T1DM病因的基礎(chǔ)。本研究預(yù)測胰島特異性miRNA如hsa-miR-493-5p和hsa-miR-127-3p會(huì)被抑制，這可能反映了T1DM中胰島β細(xì)胞的破壞狀態(tài)。

綜上所述，T1DM患者外周血hsa_circ_101079、hsa_circ_100332、hsa_circ_085129及hsa_circ_103845表達(dá)顯著上調(diào)，可能通過靶miRNAs調(diào)控相關(guān)信號(hào)通路參與T1DM的發(fā)生發(fā)展。