李 嬌 ，陳嘉璇 ，劉翁博洋 ，林上遠(yuǎn) ，黃曉宇 ，2＊，滾雙寶 ，2

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省現(xiàn)代養(yǎng)豬工程技術(shù)研究中心，甘肅 蘭州 730070）

骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族十分獨(dú)特,可誘導(dǎo)IOPC類細(xì)胞向成骨細(xì)胞方向轉(zhuǎn)化。研究表明，BMPs在造血組織、皮膚附屬物等的形成和分化以及脂肪、腎臟、肝臟、骨骼及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中起一定作用。BMP與胚胎發(fā)育過程中骨骼的發(fā)生有時(shí)空相連性，在胚胎發(fā)育的所有組織中均可檢測(cè)到低水平BMP4基因mRNA表達(dá)。M.Menzies等研究表明，BMP4基因在胎羊毛囊不同發(fā)育階段與Noggin基因共同參與了毛囊發(fā)育的調(diào)控，是細(xì)毛羊毛囊發(fā)育的關(guān)鍵決定因子。G.Thomadakis等、J.M.Wozney等研究表明，BMP4在毛囊發(fā)育時(shí)及毛球中合成角蛋白的表皮細(xì)胞中表達(dá)。通過觀察表達(dá)BMP4基因的頡頏物Noggin的轉(zhuǎn)基因小鼠，發(fā)現(xiàn)其毛發(fā)異常且形態(tài)發(fā)生改變。在絨山羊不同發(fā)育時(shí)期皮膚中的表達(dá)結(jié)果表明，BMP4基因在胚胎期上皮細(xì)胞、毛囊以及出生后毛囊生長(zhǎng)興盛期、退行期和休止期均有表達(dá)，表明其與毛囊形態(tài)發(fā)生以及出生后毛囊的發(fā)育、分化密切相關(guān)。目前，對(duì)BMP4基因與家畜皮膚毛囊關(guān)系的研究主要集中在絨山羊，尚未發(fā)現(xiàn)BMP4基因與豬毛囊發(fā)育方面的相關(guān)報(bào)道。本研究通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，檢測(cè)BMP4基因在合作豬頸部、肩部、體側(cè)、臀部皮膚的表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為揭示BMP4基因?qū)献髫i絨毛生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控機(jī)制提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)選取冬、夏季兩個(gè)季節(jié)合作豬的頸部、肩部、側(cè)部、臀部四個(gè)部位皮膚樣品，通過RT-qPCR方法檢測(cè)BMP4基因在春、夏季合作豬皮膚中的基因表達(dá)量。具體的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過程如下：

將1 2 頭（冬、夏季各6 頭）實(shí)驗(yàn)豬屠宰后快速采取皮膚組織，用PBS緩沖液清洗、標(biāo)記后迅速置于液氮中冷凍，帶回實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)移至-8 0 ℃冰箱長(zhǎng)期保存。實(shí)驗(yàn)所需合作豬由甘肅省現(xiàn)代養(yǎng)豬工程技術(shù)研究中心科研及人才培訓(xùn)基地—甘肅省甘南州迭部縣尼傲鄉(xiāng)蕨麻豬養(yǎng)殖專業(yè)合作社提供。

1.1.2 主要試劑、耗材

Trizol試劑，PrimeScript?II 1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒，合作豬各組織的cDNA，BMP4基因的上下游引物、無酶水、內(nèi)參等。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

以GenBank中豬BMP4基因核苷酸序列（NM_001101031.20）和氨基酸序列（NP_001094501.1）為參考，采用NCBI中的Primer Premier 5.0，設(shè)計(jì)BMP4基因的熒光定量PCR特異性引物，合成引物，序列見表1。

表1 熒光定量PCR 引物設(shè)計(jì)

1.3 總RNA 提取和cDNA 合成

采用Trizol萃取法提取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組合作豬頸部、肩部、體側(cè)、臀部的組織的總RNA，并分別檢測(cè)RNA完整性和純度，將得到的cDNA保存在實(shí)驗(yàn)室-20℃的冰箱中。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng)：上下游引物各為0.8 μL，cDNA模板2 μL，內(nèi)參均0.8 μL，sybr酶10 μL，RNase Free H2O補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)條件為：95℃，5 min；94℃，30 s；61℃，30 s；72℃，1 min；35個(gè)循環(huán)。所有組織都做4個(gè)樣品，每個(gè)樣品同時(shí)做3個(gè)技術(shù)重復(fù)。以2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，用SPSS 26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示結(jié)果，最終結(jié)果通過Graphpad Prism 8.0以圖片的形式展現(xiàn)出來。

1.5 生物信息學(xué)分析

從NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中下載獲取各物種的BMP4基因的氨基酸序列：野豬（登錄號(hào)：NP_001094501.1）、狗（登錄號(hào)：NP_001274099.1)、家牛（登錄號(hào)：NP_001039342.1）、野馬（登錄號(hào)：XP_023507423.1）、人（登錄：NP_001193.2）、綿羊（登錄號(hào)：NP_001103747.1）、雞（登錄號(hào)：NP_990568.4）、鼠（登錄號(hào)：NP_001303289.1）、大猩猩（登錄號(hào)：XP_004055236.1），猴（登錄號(hào)：XP_012306449.1），兔（登錄號(hào)：NP_001182652.1），用MEGA5.0軟件進(jìn)行序列比對(duì)、分析，采用表2工具進(jìn)行BMP4基因的生物信息學(xué)分析。

表2 生物信息學(xué)分析軟件工具

2 結(jié)果與分析

2.1 基因擴(kuò)增曲線

通過圖1可以得知，BMP4基因和內(nèi)參基因在擴(kuò)增時(shí)，指數(shù)期條帶走向一致且清晰，由此說明cDNA的濃度合適，適應(yīng)于采用該實(shí)驗(yàn)進(jìn)行熒光定量分析。

圖1 BMP4 基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增曲線

2.2 基因溶解曲線

通過圖2可知，BMP4基因和內(nèi)參基因的溶解曲線的多個(gè)重復(fù)均曲線一致性較好，沒有多余的雜帶出現(xiàn)，證明實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的引物良好，適合后續(xù)的實(shí)驗(yàn)分析。

圖2 BMP4 基因和內(nèi)參基因的溶解曲線

2.3 BMP4 基因在不同組織中的表達(dá)分析

采用qPCR檢測(cè)合作豬各組織中BMP4基因的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)冬季合作豬的頸部、肩部、側(cè)部和臀部的BMP4基因的表達(dá)量顯著高于夏季（P＜0.05）（表3和圖3），這個(gè)結(jié)果說明BMP4基因有抑制毛囊生長(zhǎng)發(fā)育的作用，提示BMP4基因影響合作豬絨毛生長(zhǎng)發(fā)育。

表3 合作豬不同部位、不同季節(jié)BMP4 基因的表達(dá)量

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

利用MEGA5.0軟件分析豬與狗、普通牛、人、綿羊、家鼠，雞、大猩猩、野馬、兔子和猴的核苷酸序列，制作出圖4。由圖4可知豬與牛、野馬、綿羊親緣關(guān)系較近，而與人、家鼠、猴和兔的遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)，該結(jié)果與動(dòng)物分類相一致。

圖4 BMP4 基因系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果圖

2.5 蛋白理化性質(zhì)分析

Prot Param 在線服務(wù)器分析結(jié)果顯示，豬BMP4基因編碼409個(gè)氨基酸，分子式為C2055H32221N620O597S16，等電點(diǎn)約為8.57，半衰期為30 h，如表4。

表4 合作豬BMP4 基因編碼蛋白的氨基酸組成

2.6 蛋白親疏水性分析

ExSyPA-ProtScale軟件可用于氨基酸殘基的親疏水性預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)BMP4蛋白氨基酸殘基的第307位賴氨酸親水性是最強(qiáng)的，親水值為-3.300；第14位半胱氨酸的疏水性最強(qiáng)，疏水值為+2.978；總平均親水性為-0.565，平均值為負(fù)，說明豬BMP4蛋白可能為親水性蛋白，如圖5。

2.7 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)與三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用S O P M A軟件和S w i s smodel軟件對(duì)BMP4基因編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，結(jié)果顯示：BMP4蛋白主要由α-螺旋和無規(guī)則卷曲構(gòu)成（圖6），其中α-螺旋占24.69%，無規(guī)則卷曲占比53.79%，β-轉(zhuǎn)角所占比例為2.44%，這些二級(jí)結(jié)構(gòu)單元進(jìn)一步扭曲、折疊，形成了三級(jí)結(jié)構(gòu)（見圖7）。

圖6 豬BMP4 基因編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

圖7 豬BMP4 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.8 信號(hào)肽剪切位點(diǎn)預(yù)測(cè)

運(yùn)用SignalP軟件預(yù)測(cè)，結(jié)果表明BMP4蛋白存在信號(hào)肽，且信號(hào)肽的剪切位點(diǎn)位于第24和25號(hào)氨基酸之間，如圖8。

圖8 豬BMP4 基因編碼蛋白的信號(hào)肽位點(diǎn)預(yù)測(cè)

2.9 蛋白保守性預(yù)測(cè)

運(yùn)用NCBI在線工具CDD預(yù)測(cè)保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示豬BMP4蛋白含有兩個(gè)超家族保守結(jié)構(gòu)域，即TGFb-propeptide超家族和TGF-beta-SF超家族，其分別位于303～409位氨基酸殘基與41～276位氨基酸殘基（圖9）。

圖9 豬BMP4 蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

注：*表示P＜0.05，差異顯著

2.10 合作豬BMP4 基因編碼蛋白亞細(xì)胞定位

采用PSORT II軟件進(jìn)行亞細(xì)胞定位。結(jié)果表明：BMP4基因編碼蛋白有47.8%的可能性分布在細(xì)胞核，在細(xì)胞骨架、細(xì)胞質(zhì)和高爾基體的可能性分別為13.0%、8.7%和4.3%。

3 討論與結(jié)論

倪蓉研究表明，BMPs對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育、骨骼形成、創(chuàng)傷愈合、機(jī)體疾病等方面具有重要作用,且在毛囊發(fā)育過程中發(fā)揮調(diào)控作用。BMPs信號(hào)通路可誘導(dǎo)內(nèi)源性Dsmoglein 4的表達(dá),從而調(diào)控毛囊生長(zhǎng)周期,維持毛發(fā)濾泡的穩(wěn)定性,平衡毛發(fā)的自我增殖與凋亡。BMPs信號(hào)受阻會(huì)導(dǎo)致毛囊瘤的形成。M.Blessing等研究表明：BMP4主要會(huì)在成熟毛囊的毛乳頭表達(dá)；若在轉(zhuǎn)基因小鼠的毛囊外根鞘中過表達(dá),就會(huì)抑制毛母質(zhì)細(xì)胞增殖，激活外根鞘中毛角質(zhì)蛋白基因表達(dá)，還會(huì)導(dǎo)致外根鞘及基質(zhì)細(xì)胞增殖。顧華等研究表明，不同濃度的BMP4均可促進(jìn)毛囊外根鞘細(xì)胞的增殖和遷移。毛干的分化是產(chǎn)生毛發(fā)的前提，若沒有BMP4基因的參與，毛干分化受阻，毛發(fā)也不能形成。

為了研究BMP4基因?qū)献髫i絨毛生長(zhǎng)發(fā)育的影響，本實(shí)驗(yàn)對(duì)BMP4基因進(jìn)行克隆、測(cè)序和生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明：BMP4基因編碼了409個(gè)氨基酸，半衰期為30 h，是一種親水性蛋白，含有TGFb-propeptide超家族和TGF-beta-SF超家族保守結(jié)構(gòu)域，沒有跨膜結(jié)構(gòu)域，存在信號(hào)肽位點(diǎn)。BMP4基因主要由α-螺旋（24.69%）、無規(guī)則卷曲（53.79%）和β-轉(zhuǎn)角（2.44%）組成。系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果表明豬與馬、牛、綿羊等親緣關(guān)系較近，這與動(dòng)物分類結(jié)果一致。這些結(jié)果可以為豬BMP4基因的相關(guān)研究提供參考。

注：Score0 表示疏水性；Score0 表示親水性。

毛青青等研究表明，BMP4基因在毛囊和羽毛發(fā)生發(fā)育過程中表達(dá)且主要起負(fù)調(diào)控作用。對(duì)毛囊再生，BMP4起抑制作用。吳江鴻等發(fā)現(xiàn)，BMP4基因在絨山羊皮膚次級(jí)毛囊上表達(dá)效果不同，休止期高表達(dá)，興盛期低表達(dá)，可調(diào)節(jié)山羊絨的周期性生長(zhǎng)，推斷BMP4基因可能參與調(diào)控毛囊發(fā)育，并在其中起抑制作用。

本文研究了豬BMP4基因的生物學(xué)特性，并檢測(cè)夏季和冬季BMP4基因在合作豬豬體中的表達(dá)變化與合作豬周期性生長(zhǎng)絨毛有關(guān)，冬季BMP4基因表達(dá)量高于夏季，初步推測(cè)：BMP4具有抑制毛囊生長(zhǎng)發(fā)育的作用，當(dāng)其表達(dá)量超過一定強(qiáng)度時(shí)就會(huì)抑制毛囊的生長(zhǎng)發(fā)育，導(dǎo)致毛囊密度減少。本研究結(jié)果為探索合作豬絨毛生長(zhǎng)調(diào)控分子機(jī)制和尋求育種與營(yíng)養(yǎng)手段控制絨毛生長(zhǎng)提供新的思路和方向，而且也將為毛發(fā)周期性生長(zhǎng)調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)。

（收稿日期：2022-03-14)